病毒学顶刊 J VIROL：详述流感病毒重要氨基酸位点 Y82 的作用，进一步了解病毒复制机理

2019-11-19

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2019 年 8 月下旬，日本科学家在国际权威病毒学杂志 Journal of Virology 上发表题为 Tyr82 Amino Acid Mutation in PB1 Polymerase Induces an Influenza Virus Mutator Phenotype 的文章，阐述了位于流感病毒 PB1 上氨基酸位点 Y82 的重要作用，为进一步了解流感病毒复制机理、研发抗病毒药物、抗体提供理论参考。

图片来源：Journal of Virology

本文重点介绍了 RNA 病毒特性，指出：

RNA 病毒基因组复制时，突变率为 10 - 4 至 10 - 5，这意味着每轮复制有 0.1 至 1 个基因错配；

RNA 病毒依赖的 RNA 聚合酶高错误率，使得其在一个自然种群中保持遗传变异水平；

大多数 RNA 病毒缺少 DNA 病毒复制时的高保真机制：校对和错配修复；

RNA 病毒的高度遗传多样性，使得它们具有免疫逃避、耐药性、感染宿主能力。

与此同时，依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）在 RNA 病毒复制、突变、进化等生理活动中发挥关键作用，探究 RdRp 上氨基酸位点的功能具有重要的科学意义。

前人通过利巴韦林作用于 RNA 病毒，在 poliovirus 中发现第一株 RdRp 高保真突变株，在 FMDV 中发现第一株 RdRp 低保真突变株。在 poliovirus 的 RdRp 上发现 K359 关键氨基酸位点，该位点高度保守、位于 RdRp 的 motif D 上。

图片来源：文章截图

K359 H、K359R 对 poliovirus 的复制、保真度均有影响，因此推测 K359 在其他 RNA 病毒中也发挥重要作用。序列比对显示 K359 对应于流感病毒的 K481 位。

本文以 K481 位为初始研究点，引出研究主要位点 Y82。

首先，研究者们包装出 mini-replicon reporter 系统检测流感病毒复制能力，突变 K481 /K480 /K479 分别至 H/R，发现 K479 / 480 / 481R/H 复制能力均低于 WT。

同时包装重组病毒，利用 HA 检测系统比较与 WT 的滴度差异，发现 481R/H 的 HA 滴度均低于 WT，证明了 K481R 为致死性突变， K481 H 重组病毒在鸡胚中多次传代，K481 H 的滴度上升。

经测病毒序列表明，该病毒 Y82 位点突变至 C，弥补了由 K481 H 造成的复制缺陷。

图片来源：文章截图

文中指出，流感病毒的聚合酶由 PB1 /PB1 /PA 组成， PB1 类似于手指、指尖、手掌、掌心组成的手部结构，Y82 在不同流感病毒株系间保守且位于 PB1 上及 K481 附近，当把 Y82 突变至 C 时，造成 PB1 结构变化。

图片来源：文章截图

接着构建 Y82C、Y82C/K481 H、Y82C/K481R 的 mini-replicon reporter 系统，结果表明 Y82C 复制能力与 WT 相当、Y82C/K481 H 和 Y82C/K481R 的复制能力分别高于 K481 H/R。

利用二代测序技术，发现 Y82C/K481 降低了聚合酶的保真度。这表明 Y82 的确在调节流感病毒的保真度方面发挥作用，因此进一步将 Y82 突变为其他 19 种氨基酸，包装重组病毒及 mini-replicon reporter 系统。发现 Y82 突变点对于病毒的生长曲线、RNA 聚合酶活性、复制保真度均产生影响。

有趣的是，将 Y82 突变至其他氨基酸时，均能包装出重组病毒，表明 Y82 点具有结构可塑性及较宽的突变范围替代性。