非洲猪瘟 (African swine fever, ASF) 是一种急性发热，传染性很高的滤过性病毒引起的猪传染病，死亡率高达 100%。其病原体 ASF 病毒 ( ASF virus, ASFV) 为双链 DNA(170 - 193kb) 病毒，根据毒株不同可包含 151 - 167 个基因。

近年来，ASF 的肆虐已对全球养猪业造成了灾难性的影响。中国的生猪产量占全球 50% 以上，然而中国大部分养猪场都是小型养猪场，往往缺乏足够的生物安全措施。

尽管屠宰受感染的猪能够一定程度控制 ASF，但 ASFVs 早已广泛污染了环境。与 2018 年 8 月相比，2019 年 9 月中国生猪产量下降了 40%，猪肉价格却上涨了一倍。这些事实表明，单靠捕杀受感染的猪并不能控制疫情，因此开发和应用一种有效的疫苗显得尤为重要。

2020 年 3 月 1 日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在 SCIENCE CHINA Life Sciences（《中国科学：生命科学》英文版）在线发表了题为《A seven-gene-deleted African swine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine in pigs》的论文。

研究人员以中国的非洲猪瘟病毒 HLJ/ 18 毒株为骨架，制备了一系列基因缺失病毒。通过猪体内的毒力、免疫原性、安全性和保护性功效评估发现，敲除了 7 个基因的 HLJ/ 18 - 7 GD 已在猪体内完全减毒且不能转化为强毒株，可保护猪免受 ASFV 攻击。表明 HLJ/ 18 - 7 GD 是一种抗 ASFV 的安全有效疫苗，有望在控制 ASFV 的传播中发挥重要作用。

图片来源：SCIENCE CHINA Life Sciences

为了评价不同基因缺失的 ASFVs 毒力，研究人员利用 DNA 同源重组技术，通过删除 MGF505 - 1R、MGF505 - 2R、MGF505 - 3R、MGF360 - 12L、MGF360 - 13L、MGF360 - 14L、CD2v、9 GL、DP148R、UK 等基因片段构建了 6 种不同的病毒。并将携带报告基因 GFP 和 / 或 mCherry 的基因缺失病毒在猪肺泡巨噬细胞 (PAMs) 中纯化，经序列分析命名为 HLJ/ 18 - 6 GD、HLJ/ 18 -CD2v-del、HLJ/ 18 -DP148R-del、HLJ/ 18 - 9 GL&UK-del、HLJ/ 18 -CD2v&UK-del 和 HLJ/ 18 - 7 GD。

为了研究这些基因敲除病毒在猪体内是否被减毒，研究人员为 7 周龄的无特定病原体 (SPF) 猪分别接种了 103 和 105 TCID 5 剂量的以上基因缺失病毒，并观察了猪 3 周。

结果表明，HLJ/ 18 -DP148R-del 对猪有杀伤作用，HLJ/ 18 -CD2v-del 和 HLJ/ 18 -cd2v-uk-del 对猪有轻微的杀伤作用，而 HLJ/ 18 - 6 GD、HLJ/ 18 - 9 GL&UK-del 和 HLJ/ 18 - 7 GD 的毒力在猪体内均显著减弱。

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减毒后的 ASFVs 对猪 HLJ/ 18 毒力的保护作用

为了探讨减毒病毒是否能诱导机体产生保护性免疫反应，研究人员对上述接种了 HLJ/ 18 - 6 GD、HLJ/ 18 - 9 GL&UK-del 和 HLJ/ 18 - 7 GD 的猪通过肌肉注射了 200 倍 PLD50（半数猪致死量）HLJ/ 18 病毒进行攻毒实验，并用 4 只 10 周龄的 SPF 猪作为对照实验进行攻毒。

结果发现，对照组和 HLJ/ 18 - 9 gl&UK-del 接种组均出现发热，并在 12 天内死亡。在这些猪的血液、器官和组织中利用 qPCR 也检测到高拷贝的病毒 DNA。而 HLJ/ 18 - 6 GD 组和 HLJ/ 18 - 7 GD 组均存活，仅有一段时间的发热症状。在这些猪的一些器官或组织中也同样检测到病毒 DNA，不过值得注意的是，HLJ/ 18 - 7 GD 组的猪体内检测到的病毒 DNA 明显低于其他组。

这表明毒株 HLJ/ 18 - 9 GL＆UK-del 不诱导任何保护作用，而毒株 HLJ/ 18 - 6 GD 和 HLJ/ 18 - 7 GD 均具有免疫原性，且能够保护猪免于致命的 ASFV 攻击。

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HLJ/ 18 - 6 GD 和 HLJ/ 18 - 7 GD 在猪体内的安全性评价

对减毒活疫苗的最大担忧是疫苗种子病毒是否能在疫苗接种动物中的复制期间转化为强毒株。

为此，研究人员按照中国减毒活疫苗开发指南 (http:// www.moa.gov.cn)，将采集的 HLJ/ 18 - 6 GD 阳性血液感染其他 SPF 猪进行了 4 次传代。之后第 5 代在第 5、10 和 15 天采集血样，并收集第 21 天处死的每只猪的器官和组织检测病毒 DNA。

研究发现，HLJ/ 18 - 6 GD 病毒在猪体内的复制效率越来越高。值得注意的是，第 5 代 HLJ/ 18 - 6 GD 病毒中的一头猪发展为严重疾病，并在第 11 天死亡。从该猪中再接种 5 头猪（第 6 代），所有猪血液和器官均具有高病毒 DNA 拷贝，且其中一只表现出严重症状在感染后第 13 天死亡。结果表明，HLJ/ 18 - 6 GD 病毒在猪中复制过程中可能具有更高的毒性。

另外，研究人员同样将 HLJ/ 18 - 7 GD 接种的猪病毒 DNA 阴性血进行了 4 次传代，但是在这些猪的任何样本中都没有检测到病毒 DNA。

为了进一步研究 HLJ/ 18 - 7 GD 在猪体内的复制情况，对 14 只 7 周龄 SPF 猪以 107.7 TCID50 高剂量接种，2 天、5 天、8 天、10 天、12 天、16 天和 21 天分别实施安乐死。收集这些猪的血液和器官进行病毒 DNA 检测。

然而病毒 DNA 未在任何猪的血液、心脏、肝脏等器官中检测到，仅在部分猪的某些淋巴结中检测到了病毒 DNA。

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以上结果表明，肌肉注射 HLJ/ 18 - 7 GD 病毒后，病毒仅在猪的某些淋巴结中维持较短的时间，在猪的血液或任何其他器官中均未出现。因此，HLJ/ 18 - 7 GD 在猪的复制过程中不太可能转化为毒性毒株。

基于这些安全性评估，研究人员最终选择了 HLJ/ 18 - 7 GD 病毒作为 ASF 的疫苗株。

HLJ/ 18 - 7 GD 对商业猪和妊娠母猪的保护作用

由于单剂疫苗引起的保护性免疫在几周内可能会下降，因此在实际的动物疾病控制中一般需要接种第二剂疫苗。

首先，研究人员对 7 周龄商业仔猪接种了一到两次 (间隔 3 周)105 TCID50 疫苗，然后在接种后的不同时间点进行攻毒并设置对照组。所有猪在接受 HLJ/ 18 病毒感染后观察 3 周。收集死猪和第 21 天处死的幸存猪的器官组织，用 qPCR 进行病毒 DNA 检测。

结果发现，所有攻毒研究的对照组猪在攻毒后 11 天内死亡，而接种一剂 105 TCID50 疫苗的猪都存活了 3 周，但在血液中检测到病毒 DNA，这表明 HLJ/ 18 - 7 GD 在商业猪和 SPF 猪中提供了类似的保护。

随后，研究人员又通过口服攻毒实验以及使用 5 月龄商业猪进行实验，并且探索更高的接种剂量是否能引起更好的长期预防。

其结果表明，接种单剂量的 106 TCID50 的 HLJ/ 18 - 7 GD 可针对 ASFV 攻毒提供持久的免疫保护，并且注射两次 HLJ/ 18 - 7 GD 可以为猪的一生提供持续免疫保护。

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最后，研究人员也调查了疫苗在怀孕母猪中的安全性，结果显示所有母猪接种后均保持健康，并在预定日期分娩，说明接种 HLJ/ 18 - 7 GD 不会引起妊娠母猪疾病或流产，也不会影响仔猪健康。

有望大规模生产并投入应用

以往的研究表明，ASF 疫苗在适应细胞系后很容易丧失免疫原性，并且不能赋予猪抵抗同源病毒攻击的保护作用。提示 ASF 疫苗应在原代细胞中生产，但这也可能会限制大规模生产。

幸运的是，在此之前哈尔滨兽医研究所的研究人员就已解决了非洲猪瘟疫苗大规模生产的工艺的问题，并建立了非洲猪瘟疫苗产品的质量标准。

此次的研究发现该疫苗株可在 SPF 猪原代骨髓细胞（PBM）高效培养，并且从一只 SPF 仔猪得到的 PBM 可以生产至少 20 万剂疫苗（106 TCID50 / 剂量），完全具备大规模生产条件。

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值得一提的是，在过去的几十年里，针对 ASFV 的不同疫苗策略，如灭活疫苗、DNA 疫苗、亚单位疫苗和腺病毒载体疫苗已经过测试但证明不能有效达到免疫预防目的。

而相比之下，通过敲除某些基因构建基因缺失毒株显示出作为减毒活疫苗的巨大潜力，但尚不清楚它们在猪中复制过程中是否能转化为更具毒性的毒株。

在此之前，美国国土安全部梅岛动物疫病中心的科研人员也同样通过删除一个名为 I177L 的基因，开发出一种非常有希望的非洲猪瘟候选疫苗。在猪的小规模试验中表明其保护率可达 100%，不过为了进一步评价该疫苗的安全性和有效性，还需要更大规模的实验。

参考资料:

http://engine.scichina.com/publisher/scp/journal/SCLS/doi/10.1007/s11427 - 020 - 1657 - 9?slug = fulltext