实验时间｜大肠杆菌转化实验

大肠杆菌转化实验有热击法、CaCI2 转化法、一步法、高效率电转化法，今天主要来讲下热击法。

质粒 DNA 或重组 DNA 粘附在细菌细胞表面，经过 42°C 短时间的热击处理，促进吸收 DNA. 然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

☞ 实验材料准备

1. 器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体 LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

2. 试剂

培养基（不加抗菌素），LB 培养基（加抗菌素），无菌 ddH2O，IPTG，X-gal。

3. 材料处理

无菌 ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20% IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用 N,N - 二甲基甲酰胺配）。

☞ 操作步骤

1. 事先将恒温水浴的温度调到 42 ℃。

2. 从 -70 ℃ 超低温冰柜中取出一管（100 μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴 5～10 min。

3. 加入 5 μl 连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过 100 ng），轻轻震荡后放置冰上 20 min。

4. 轻轻摇匀后插入 42℃ 水浴中 1～2 min 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 3～5 min。

5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入 500 μl LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37 ℃ 震荡 1 h。

6. 在超净工作台中取上述转化混合液 100～300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体 LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加 40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37 ℃ 恒温培养箱中 30～60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37 ℃ 恒温培养箱过夜。

9. 在被细菌污染的桌面上喷洒 70% 乙醇，擦干桌面，写实验报告。

10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。