番茄基因组的高效遗传修饰：作者Q+A

Tomššermák是明尼苏达大学生物科学学院的研究专家。

你能简要地概述一下你的研究目标吗？

自从TALEN和CRISPR/Cas9核酸酶的发现以来，基因组工程领域的研究进展迅速，但对植物基因组进行精确的修饰仍然是一个挑战。到目前为止，只有少数几个小组成功地以一种定制的方式改变了作物的基因组。

我们决定开发更有效的方法来降低植物基因打靶的挑战性，并证明它们可以应用于重要的作物品种。

为什么在过去很难修改植物基因组？

过去我们没有有效的工具来控制基因组。现在这种情况已经改变，TALENs、CRISPR/Cas9或其他类型的位点特异性核酸酶可以用来诱导感兴趣基因中的靶向双链断裂。

然后，这些断裂被突变的非同源末端连接修复，这种连接通常导致基因失活，或者更不常见的是，通过同源重组导致精确修复。因此，这些工具现在已经到位，但在修改特定植物基因组方面仍有其他挑战。

主要问题在于将DNA导入植物组织的方法（与许多动物细胞系统相比）效率低下。受细胞壁保护的植物细胞不易吸收外源DNA，必须以生物方式或通过使用生物制剂农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将外源DNA导入细胞。

如果单拷贝转基因被插入到基因组中，这不是一个大问题。一份位点特异性核酸酶转基因通常也足以诱导靶基因敲除。

然而，基因靶向（通过同源重组引入精确的、定制的修饰）需要携带期望修饰的供体DNA分子用作复制信息和修复断裂的模板。

增加这些供体分子在细胞中的拷贝数会增加其中一个分子被用作修复模板的机会。然而，通过上述方法调节外源传递给植物细胞的DNA拷贝数是困难的，而且通常只能传递一个或几个拷贝。

你的技术和传统的方法有何不同？

以前用于植物基因打靶的大多数方法要么使用植物原生质体（没有细胞壁的植物细胞）作为DNA传递的起始材料，要么使用农杆菌介导的DNA传递到植物组织中。

此外，许多使用预插入的着陆垫或转基因作为目标。虽然将DNA导入原生质体比导入完整的组织要容易得多，但从原生质体中再生整株植物需要相当程度的专业知识，而且仅在少数植物物种中是可能的。

另一方面，农杆菌介导法也存在上述缺点，但仍是最常用的转化方法。我们结合农杆菌递送和一个新的系统，在植物细胞内复制DNA供体分子，以增加基因靶向频率。

供体模板被放置在一个双子病毒复制子上，这个复制子从农杆菌T-DNA中释放出来，循环复制成数千个拷贝，与传统方法相比，可以显著地提高DNA的转化率。

虽然我们之前在烟草愈伤组织/植株中发表了这种方法的概念证明，但在当前的研究中，我们将其应用扩展到了第一个作物品种番茄，这一作物品种之前没有通过基因打靶进行过修饰。

我们培育了转基因植株并证明了这些转基因是可遗传的。我们以一个内源性基因为靶点，并首次证明，可以结合使用容易定制的核酸内切酶（CRISPR/Cas9和TALENs）。

也许最重要的是，与植物中的其他基因靶向方法不同，我们表明T-DNA整合对于利用genimivirus复制子实现基因靶向不是必需的，这与使用我们的方法制作的作物品种的调节状态有关。

你觉得这项研究有什么特别的挑战吗？

在一个新物种中实施一种新的方法总是具有挑战性的。最大的挑战是如何优化具有基因打靶事件的植物的整个恢复过程，这是一个需要大量时间的过程。

这项技术在番茄或其他作物上可能有哪些应用？

我们的方法不仅可以通过对基因功能的有针对性的修改来促进基础生物学的发展，而且还可以用于作物改良以创造新的感兴趣的性状。

这项技术使我们能够利用植物基因组工程的全部潜力，通过目标基因插入、基因堆叠或氨基酸/等位基因替换的碱基替换，扩展可能的基因组编辑结果列表。利用这项技术，番茄和其他作物有许多特性可以优化。

你希望这在未来会有怎样的发展？

尽管我们的方法代表了植物基因组工程的一个重大进展，但对植物基因组进行精确的修改仍然远远不是常规的。最受追捧的未来目标是使植物的基因靶向性如此有效，以至于不需要选择就可以鉴定出转基因植物。

我们通过解决植物细胞基因靶向的一个重要方面——供体模板的可用性，向这个目标又迈进了一步。在下一步中，我们希望消除农杆菌转化的限制，使复制子能够在细胞间移动。

这将导致携带基因组工程试剂的复制子从最初转化的细胞扩散到其他细胞，进一步提高基因靶向效率。