Cas9-一种蛋白质可以控制所有蛋白质

CRISPR / Cas的美丽编辑系统,虽然单指南RNA (sgRNA),简单的设计和合成,是决定整个工具的目标属性,Cas9——一个稳定的,不变的元素——只负责一件事:切割DNA链的地方它是引导。

我们常常过于关注单一引导rna的优点和局限性，以至于忘记了Cas9本身有一个重要的限制:只有在sgRNA识别的DNA序列旁边存在所谓的protospacer邻近motif (PAM)时，它才会切断该序列。PAM是一种特殊的短序列:最常用的野生型化脓性链球菌Cas9 (SpCas) PAM使用NGG(其中N为任意碱基)。这对于精确的基因编辑来说是一个明显的障碍——sgRNAs的长度是有限的，因此如果在基因组中没有PAM序列接近我们想要修改的位置，这可能根本就不可能。

不出所料，许多研究都集中在扩展Cas9蛋白识别的PAMs序列上。

Cas9的许多面貌

事实证明，PAM并不是一种保守的特性——它对不同细菌种类的Cas9蛋白有不同的表现。另外一种Cas9可以用于基因组编辑已经被证明过几次了。在2013年的一篇早期CRISPR基因组编辑文章中，张峰、Luciano Marraffini及其同事描述了来自嗜热链球菌(St1Cas9)的Cas9小蛋白。该蛋白比SpCas9小(3.3kb vs 4.5 kb)，但其PAM序列NNAGAAW相当复杂，甚至比SpCas9的限制性更强。

然而，今年早些时候，张峰和他的同事在《自然》杂志上发表了一篇文章，描述了使用另一种来自金黄色葡萄球菌(SaCas9)的Cas9酶进行体内编辑的过程。

SaCas9有一些有趣的属性:它是和SpCas9一样高效的编辑器;它的PAM虽然比SpCas9的PAM长，但非常通用(NNGRRT);这种酶最有趣的特点是它的大小——只有SpCas9的四分之三。为什么这很重要?在许多应用中，腺相关病毒(AAV)载体被用于体内传递。然而，将大型SpCas9和单个guide RNA打包成一个载体是很棘手的，因为载体的大小仅仅比这些结构的大小(4.2 kb)大一点。对于较小的SaCas9来说，这不是什么大问题。

在一篇发表在《基因组生物学》上的文章中，David Bumcrot和他的同事从其宽松的PAMs角度对SaCas9进行了彻底的描述。重要的是，他们还描述了一种带有SaCas9的AAV载体的设计，其中包括两个而不是一个引导rna。作者推测，使用不同的启动子(人类tRNA启动子只有70个bp，而不是目前使用的250个bp的U6启动子)，可能会在同一构造中包含更多的sgrna。

不过，寻找另一个Cas9的工作还没有结束。在《基因组生物学》关于基因组编辑的专刊上发表的另一篇文章中，Virginijus Siksnys和同事描述了一种描述PAMs的方法，并指导新发现Cas9蛋白的RNA需求。通过这种方法，他们确定了SpCas9、St1Cas9和St3Cas9的典型PAMs，同时也鉴定了来自短孢杆菌(BlatCas9)的Cas9新酶的PAM，并展示了其在植物编辑中的应用。有了这种发现PAM的简单方法，任何携带cas9的细菌都突然成为一种新的生物技术工具的潜在来源。

弗兰肯斯坦的Cas9

如果你更精通生物工程，不喜欢新的Cas9搜索，那么还有另一种方法可以扩大PAMs的库——也就是可以用CRISPR/Cas系统定位的基因组中的位点库。即:用改变的PAM特性来设计特定Cas9的变种。

这就是Keith Joung的团队所采取的方法。去年6月，该小组在《自然》杂志上发表了一篇文章，描述了SpCas9蛋白的工程:利用这种酶的结构信息、基于细菌选择的定向进化和组合设计，研究人员获得了许多具有不同PAM需求的SpCas9变体。然后他们在斑马鱼胚胎和人类细胞中测试了其中的两个。

本月早些时候，作者在《自然生物技术》上发表了一篇关于SaCas9的类似研究。你可能还记得这种酶有一种非常灵活的PAM的NNGRRT。Joung和同事利用他们的技术设计了一个带有NNNRRT原临近基序的SaCas9变体。这增加了该核酸酶的靶向范围2 - 4倍!

有趣的是，在第二篇文章中，研究人员不再使用结构信息:这些结果纯粹是通过分子进化来修饰SaCas9的PAM而获得的。这扩大了这种方法的适用性，因为许多新的Cas9蛋白质的结构信息可能无法获得(事实上，目前只有少数的Cas9蛋白质的结构已经晶体化)。

10月份《自然方法》上的一篇文章提出了一种稍微不同的生物工程方法:Scot Wolfe和他的同事描述了Cas9与可编程dna结合域的融合。该结构域可与sgRNAs协同设计，从而显著提高识别特异性。更重要的是，SpCas9融合蛋白对一系列PAMs (NAG、NGA、NGC和(SpCas的canonical) NGG)同样有效。可以想象，在未来，如果可以设计出一种核酸酶，其中的DNA亲和力由其识别序列定义，融合区域非常高，PAM识别位点可能不再重要。

跑掉的那个

虽然主要的焦点仍在Cas9核酸酶上——因为它是最具特征、最具商业价值的crispr系统酶，可用于基因组编辑实验——但该领域研究人员的注意力最近转移到了另一种蛋白质上。

今年9月，张峰(Feng Zhang)和同事在《细胞》(Cell)上报道了一种新的rna引导的2类V系统内切酶:Cpf1。这种酶相对Cas9的一个主要优势是，它与CRISPR阵列的相互作用不依赖于tractRNA (Peter Fineran和他的同事提供了基因组生物学研究重点中这些差异的更详细的解释)。此外，Cpf1的crRNAs比Cas9的要短得多。所有这些都意味着，用于生物工程目的的引导rna的合成应该比Cas9实验更简单、更快、更便宜。

但是Cpf1有它自己的限制:当然，其中之一是PAM。它的PAM要求是TTN和CTA——有趣的是，与Cas9相比，它们位于间隔器的另一边。然而，考虑到已经开发了大量解决方案来解决Cas9中的PAM限制问题，可以预见在不久的将来类似的方法将被用于Cpf1，这并不是什么大的想象范围。