表观健康儿童 HLA-B27 的参考值区间建立和验证
作者来自：南京医科大学附属儿童医院
人白细胞抗原 B27（human leukocyte antigen B27，HLA-B27）与强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）密切相关，AS 患者中 HLA-B27 的阳性率可达 90%[1]，HLA-B27 与反应性关节炎、银屑病关节炎等其他脊椎关节病的关系也有一些研究报道 [2]。HLA-B27 对脊柱关节病的诊断和鉴别诊断有重要的参考价值。
流式细胞技术是目前检测外周血淋巴细胞 HLA-B27 表达的主要方法之一，但 HLA-B27 参考区间缺乏统一标准，临床实验室多采用厂家提供的区间，这些参考值也未区分成年和儿童；目前也未见有儿童 HLA-B27 参考区间的报道。国际风湿病学会联盟（International league of association for rheumatology，ILAR）最新标准中将传统的幼年强直性脊柱炎归入附着点炎症相关型幼年特发性关节炎（enthesitis related juveniIe idiopathic arthritis，ERA）[3]。
我们在工作中会遇到这样的情况，临床医生根据症状和体格检查等高度怀疑患儿是一个 ERA，但是 HLA-B27 检测结果为阴性，或为接近阈值的灰区，这就给临床诊疗带来一定困扰。我们考虑儿童和成人的 HLA-B27 表达强度是否存在差异，拟自行建立本实验室的儿童 HLA-B27 参考区间，将新旧参考值范围做一致性检验，并用健康儿童和 ERA 患儿对新参考值的诊断效果进行验证。
研究内容
纳入 460 名正常儿童作为参考区间建立人群，另纳入 200 名正常儿童和 50 名 ERA 患儿作为参考区间验证人群。正常组儿童均无 ERA 自觉症状，体格检查和相关实验室指标无异常。ERA 患儿依据 ILAR 相关标准明确诊断。由于研究人群的特殊性，临床上完全健康的体检儿童较少，我们将一些先心病、腺样体肥大等对 HLA-B27 表达影响小的患儿纳入到正常组。
流式细胞仪及配套 HLA-B27 试剂盒、溶血素均为同一厂家提供。以 CD3 - 藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的 T 淋巴细胞设门，检测门内细胞 HLA-B27 表达的平均荧光强度。
正态分布的检测数据以（x±S）表示，组间比较采用单因素方差分析；偏态分布的检测数据以中位数 M（P2.5～P97.5）表示，组间均数比较采用非参数 Kruskal wallis 检验。不同参考区间采用一致性检验 (Kappa 检验)，以 kappa 值判断 2 个参考区间的一致性，以 p<0.05 为差异有统计学意义。
研究总结及结论
1. HLA-B27 平均荧光强度检测结果呈偏态分布（Z＝1.615，P=0.011），采用 M（P2.5～P97.5）表示为 100（78.00～121.00）。不同年龄和性别儿童 HLA-B27 无差异（p>0.05）。HLA-B27 只在升高时才有临床意义，因此采用百分位数法建立儿童 HLA-B27 单侧参考区间为 0-121.00。旧参考区间为 0～147。
2. 对 2 个参考区间进行一致性比较，显示一致性较差（kappa=0.013，p<0.001），说明用这两个参考区间分析同一个指标时，得到的结果可能不同。
3. 新参考区间判断正常儿童 HLA-B27 的异常率 5.0%，ERA 患儿阳性率 78%；旧参考区间判断 HLA-B27 的异常率为 3%，ERA 患儿阳性率 26%；二者总异常率无差异（χ2=1.41，p>0.05），阳性率有差异（χ2=49.18，p<0.001）。2 种参考区间判断 HLA-B27 的特异性均较好，误诊率较低；但新参考值敏感性高于旧参考值，提示旧参考区间可能会造成漏诊。
新参考区间用于表观健康儿童的的诊断效果验证
新参考区间用于幼年强直性脊柱炎患儿的诊断效果验证
HLA-B27 在所有有核细胞表面都有表达，但主要表达于淋巴细胞。儿童免疫系统尚在发育中，免疫细胞表面抗原可能未分化完全或未充分暴露；另外，AS 只有进展到一定程度时影像学检查才有表现出特征性的脊柱改变和骶髂关节炎症改变，HLA-B27 表达强度是否和疾病的进展有关。我们考虑，这些因素可能会造成儿童表达强度低于成人。
延伸阅读
除了仪器状态、荧光抗体质量，很多实验细节都会对流式细胞技术的检测结果有重要影响。我们曾用某品牌生理盐水作为离心重悬细胞这一步骤的溶液，发现所有 HLA-B27 检测结果比用 PBS 缓冲液（PH=7.4）的检测结果低 5-22，可能是生理盐水本身的 PH 就不是荧光染料的最佳 PH，而且生理盐水基本不具有缓冲能力，维持溶液 PH 稳定的能力差，这就会造成一些靠近阈值的阳性结果检测为阴性，出现漏诊。这也提醒我们，在日常检验工作中不放过每一个不起眼的 “细枝末节”，这样才能确保检测结果的真实准确。
