断骨难愈合？中科院邹卫国等 Sci Adv 报道其中表观遗传学调控关键分子​

骨折常见于人体受到高冲击力或压力，以及骨质疏松症或一些癌症引起的骨损伤。一般情况下，骨骼具有快速有效自我修复的能力，但仍有 5％ 到 10％ 的病例在骨折后愈合不良，临床研究表明，糖尿病、甲状腺功能减退、衰老和血管疾病等都与骨折愈合缺陷有关。

为了解决这一临床问题，需要进一步理解骨折愈合缺陷的机制，即调节骨再生所必需的信号通路。 初入 11 月，中科院生物化学与细胞生物学研究所（分子细胞科学卓越创新中心）邹卫国研究员连续在国际高水平杂志 JCI、Science Advances 发表文章，取得丰硕的成果。
丁香学术列表转载了对邹卫国组JCI文章的专家解读和点评，在此对今天新鲜出炉的 Sci Adv 文章进行解读，为大家展示表观遗传调控在骨折后愈合时软骨骨化过程的关键作用。

2020 年 11 月 4 日，邹卫国研究员在 Science Advances 上发表题为 Histone demethylase LSD1 is critical for endochondral ossification during bone fracture healing 的研究。该研究发现组蛋白修饰酶 LSD1 及维甲酸信号通路在骨再生中发挥重要作用，LSD1 缺失的细胞或小鼠愈合能力严重受损，推进了人们骨再生的理解和对再生医学的临床应用。

研究内容
1. Prx1 细胞中的 LSD1 缺失导致骨折愈合受损

Prx1 谱系细胞是骨折愈合的主要来源，因为几乎所有的愈伤组织细胞成分都来自 Prx1 谱系细胞。组蛋白去甲基化酶 LSD1 在骨稳态中起着重要的作用，因此该研究首先探究了 Prx1 细胞中 LSD1 缺失对骨折愈合的影响。

在对照小鼠中，骨折后第 14 天（14 days post fracture， 14 dpf）明显可见硬组织开始愈合，且愈伤组织逐渐减小，表明组织呈自愈合的状态。然而，Lsd1Prx1 小鼠在 14 dpf 及以后的时间点几乎都无法辨认其愈伤组织，在 42dpf 可见骨折不愈合（图 1）。该结果表明 Prx1 谱系细胞中 LSD1 的表达是骨折愈合所必需的。
2. 缺乏 LSD1 的 Prx1 细胞导致软骨形成因子 SOX9 表达降低

为了进一步探究 Lsd1^Prx1 中抑制软骨愈伤组织形成的原因，作者对 Lsd1^Prx1 来源的 Prx1 细胞进行 RNA 测序，结果发现，软骨形成因子 Sox9 的表达在 Lsd1^Prx1 的细胞中被显著抑制。与 Sox9 表达降低一致的是，在 Lsd1^Prx1 细胞中，SOX9 靶基因和软骨细胞标记基因的表达也被显著抑制。 于是，作者进行了 LSD1 对软骨细胞分化的分析。实验发现，Lsd1^Prx1 细胞的软骨细胞分化受到抑制，同时 Sox9 和其他软骨细胞标志物的表达水平降低，这表明 LSD1 的丧失抑制了骨膜细胞的软骨细胞分化。

此外，Lsd1^Prx1 小鼠的骨骼表型非常类似于 Sox9 杂合小鼠，出现了短而弯曲的肢体、肩胛骨发育不良、无肱骨三角肌隆起等等表型（图 2）。以上结果表明 LSD1 在骨骼修复和骨骼发育过程中调控 SOX9 的表达水平。

3. LSD1 通过抑制 ALDH1A2 抑制维甲酸（RA）信号传导

已有研究表明，LSD1 对其 H3K4me1 / 2 脱甲基酶活性起转录抑制作用，对其 H3K9 脱甲基酶活性起转录激活作用。由于 LSD1 的缺失不会改变 Sox9 启动子区域的 H3K9 甲基化水平，因此作者猜测 LSD1 可能通过其 H3K4me1 / 2 脱甲基酶活性来抑制调控 Sox9 表达的信号通路。 为了验证该猜想，该研究分析比对了一系列抑制 SOX9 的通路，包括 Wnt /Notch/ RA / 肌动蛋白聚合信号通路。结果发现，与 RA 信号通路相关的基因在 Lsd1^Prx1 中富集，其中 Aldh1a2 差异最大。ALDH1A2 是乙醛脱氢酶的家族成员，可催化从视黄醛到 RA 的合成。

通过进一步的 ChIP-qPCR 实验表明，LSD1 可直接与 ALdh1a2 的启动子区域结合，而 LSD1 的缺失改变了 Aldh1a2 启动子上的组蛋白 H3K4 甲基化状态，使其呈转录激活状态（图 3）。因此，可以得出结论 LSD1 负调控 Aldh1a2 和 RA 信号传导。

4. RA 信号增强会抑制 SOX9 表达和骨折愈合

最后，该研究欲探究 RA 是否会在骨折愈合过程中影响软骨愈伤组织的形成。对野生型小鼠进行了股骨骨折，并从 4 dpf 开始每天进行 ATRA（全反式维甲酸）或玉米油作为对照组治疗。在 14 dpf 时，发现 ATRA 处理的小鼠未能形成正常的硬愈伤组织。但随后通过 RA 抑制剂 AGN193109 抑制 RA 通路，可挽救软骨细胞分化缺陷（图 4 上）。类似地，对 Lsd1^Prx1 小鼠 2 dpf 到 12 dpf 进行 AGN193109 处理，在 14 dpf 时出现软骨愈伤组织（图 4 下）。总体而言，这些数据表明 RA 信号抑制了 Lsd1^Prx1 小鼠的骨折愈合并导致了骨折修复受损，并可以通过抑制 RA 信号通路来恢复表型。

研究总结

总的来说，该研究突出了组蛋白修饰酶 LSD1 在骨折愈合过程中的关键作用。LSD1 可通过直接靶向并通过组蛋白修饰抑制 Aldh1a2 来抑制骨折愈合细胞中的维甲酸（RA）信号。LSD1 的缺失会增加 RA 信号传导，从而导致 SOX9 水平降低和软骨愈伤组织形成受损，从而导致骨折愈合损伤。该研究将有益于糖尿病、甲状腺功能减退等疾病导致的骨折愈合不良的临床治疗。

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