使用试剂盒测定一氧化氮含量

NO（Nitric Oxide，NO）广泛分布于生物体内，包括神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，尤其是神经组织中较为丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。

NO 是一种极不稳定的生物自由基，在体内或水溶液中极易氧化生成 NO₂^2- 和 NO₃^3-，NO₃^3- 可以通过镉被还原为 NO₂^2-，NO₂^2- 在酸性条件下与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物生成重氮化合物，再与萘基乙烯基二胺进行偶联反应，生成有颜色的化合物，通过分光光度计在 550 nm 下测定吸光度值，并制作标准曲线，通过标准曲线可以计算 NO 含量。

天平、分光光度计/酶标仪、低温离心机

水浴锅/恒温培养箱、玻璃比色皿/96 孔板

移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管

一氧化氮（NO）含量检测试剂盒（索莱宝 BC1475）

溶液的配制：

1、 试剂一：粉剂置于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水混匀，-20 ℃ 分装保存两周，避免反复冻融；

2、 显色液：临用前按照实验所需用量按 A 液 : B 液 = 1 : 1 充分混匀，现配现用；

3、 标准品：10 μmol/mL 亚硝酸钠。

一、样本处理

1、组织样本：按质量（g）: 提取液体积（mL）1 : 5~10 比例（建议称取 0.2 g 样本，加入 1.0 mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后，于 4 ℃，12000 rpm，离心 15 min，弃沉淀，取上清液于冰上待测。

2、细胞样本：按细胞数量（10⁴）: 提取液体积（mL）500~1000 : 1 的比例（建议 1000 万细胞加入 1.0 mL 提取液）加入提取液，冰浴超声破碎细胞（功率 300 w，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 3 min），然后于 4 ℃，12000 rpm，离心 15 min，弃沉淀，取上清液于冰上待测。

3、液体样本：直接测定，若液体有浑浊则离心取上清测定。

二、测定步骤

1、分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 550 nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一置于冰上备用。

3、标准液的稀释：将标准品用蒸馏水倍比稀释至 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 μmol/mL。标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需 100 µL 标准溶液。

4、操作表：

漩涡混匀，置于 37 ℃ 恒温培养箱/水浴锅中水浴 60 min。

漩涡混匀，室温静置 5 min，3500 rpm 离心 10 min，取上清液待测。

漩涡混匀，室温静置 10 min，用玻璃比色皿/96 孔板在 550 nm 下测定吸光值 A，分别记为 A 空白、A 测定、A 标准，计算 ΔA 标准 = A 标准 - A 空白，ΔA 测定 = A 测定 - A 空白。标准曲线和空白管只需测 1~2 次。

三、NO 含量计算

1、标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 X 轴（X，μmol/mL），其对应的 ΔA 标准为 Y 轴（Y，ΔA 标准），绘制标准曲线，得到标准方程 Y = kX + b，将 ΔA 测定带入方程得到 X（μmol/mL）。

2、NO 含量的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

NO 含量（μmol/mg prot）= X × V _样 ÷（V _样 × Cpr）= X ÷ Cpr

（2）按样本质量计算

NO 含量（μmol/g 质量）= X × V _样 ÷（W × V _样 ÷ V _样总）= X ÷ W

（3）按样本细胞数量计算

NO 含量（μmol/10⁴ cell）= X × V _样 ÷（V _样 × 细胞数量 ÷ V _样总）= X ÷ 细胞数量

（4）按样本液体体积计算

NO 含量（μmol/mL）= X × V _样 ÷ V _样 = X

V _样：加入样本体积，0.1 mL；V _样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；细胞数量：以 10⁴ 为单位，万个。

1、试剂盒 2~8 ℃ 保存。最低检出限：0.0004 μmol/mL，线性范围：0.00078~0.1 μmol/mL。检测值最好落在检出限的中间区段，增加数据的可靠性。

                                                                       
2、尽量使用新鲜样品进行检测。实验之前建议选择 2~3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。