MTT 法检测药物对细菌的半抑制浓度

MTT 又名噻唑蓝【3-（4 ,5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2, 5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，中文名为 3-（4, 5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝】，是一种黄颜色染料，可用于检测细胞的存活和生长情况。

活细胞线粒体中（原核细胞则位于细胞膜上）的琥珀酸脱氢酶 （Succinate dehydrogenase） 能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 （Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜 （Dimethyl sulfoxide, DMSO） 能够溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在 490 nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与活细胞数成正比，可以间接反映活细胞的数量，定量评价供试药物的毒性。根据检测数据，计算可得供试药物对细胞的半抑制浓度。

广泛应用于药物对体外培养的细胞毒性的测定。

试剂：

MTT（噻唑蓝）、LA 平板

LB 液体培养基、PBS、DMSO 等

供试菌株和待测样品：

大肠杆菌 （Escherichia coli）

枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 

待测药物、硫酸链霉素（阳性对照）

实验器材：

2 mL 离心管、50 mL 离心管、96 孔板

10 μL 移液枪、200 μL 移液枪

1000 μL 移液枪、10 μL 枪头

200 μL 枪头、1000 μL 枪头

血球计数板、离心管架、恒温震荡摇床

石英比色皿、酶标仪

多通道移液器（排枪）等

待测药物对细菌的细胞毒活性检测（以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为例）的步骤如下：

（1）配制 MTT 和梯度浓度的药物：

a. PBS 磷酸缓冲液 （1 L，调节 pH = 7.4）

b. MTT （5 mg/mL）：称取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃ 避光保存；

c. 待测药物：称取约 0.5 mg 待测药物，用 DMSO 配成 2.56 mg/mL 的初始浓度，建议预实验稀释的系列梯度浓度分别为 2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL（该浓度范围仅供参考，具体药物浓度请根据自身实际情况进行设立），后根据实验结果再选择更精细的浓度；硫酸链霉素的浓度与待测药物一致。

（2）绘制标准曲线：

a. 菌种活化：取相应的斜面菌种各 1 支，无菌挑取、划线接入 LA 平板，37 ℃ 黑暗倒置培养 12~14 h；

b. 菌种培养：确定细菌在平板上生长状态无误后，接入 LB 液体培养基中，37 ℃ 、180 rpm 摇培 12~14 h 至浑浊；

c. 接种、孵育和检测：分别吸取 1 mL 菌液至 20 mL LB液体培养基中，混匀后 37 ℃、180 rpm 摇培，依次按时间取出摇培 0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h 的菌液，紫外分光光度计在 600 nm 波长处测定菌液的OD值；

d. 绘制曲线：将所测得的一组 OD 值为纵坐标、时间为横坐标，绘制出该菌的生长曲线。

（3）培养靶标细菌：活化靶标细菌，并将活化好的靶标细菌接入 LB 液体培养基中，紫外分光光度计在 600 nm 波长处测定菌液的 OD 值，按照标曲在超净工作台内将其稀释至 1×10⁶ CFU/mL；

（4）共培养：超净工作台内，在无菌的 96 孔板中的每个小孔中加入 95 μL 稀释好的菌液和 5 μL 待测药物，溶剂对照为 DMSO，阳性对照为硫酸链霉素溶液，每个处理重复 3 次，混合均匀后 37 ℃ 静置培养 16~18 h；

（5）检测：向 96 孔板的小孔内加入 10 μL MTT 溶液，常温显色 4 h 后肉眼观察其 MIC 值（最小抑菌浓度）。

将产生沉淀的 96 孔 板，在 1500 g 离心 20 min，弃去上清，每孔加入 150 μL 的 DMSO，摇板上振荡 30 min 终止反应并充分溶解沉淀。用酶标仪检测在 490 nm 波长处各孔的吸光值。

这里半抑制浓度采用改良寇式法进行计算，公式：

（6）1 g IC₅₀ = Xm-I [P -（3 - Pm - Pn）/ 4]

Xm：1g 最大剂量

I：1g（最大剂量/相临剂量）

P：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

其中，最大阳性反应率是指最大抑制率，最小阳性反应率是指最小抑制率，药物抑制率 = 1 - 加药组 OD 值 / 对照组 OD 值，将所得数据代数计算即可。

1）MTT 建议现配现用，分装后 -20 ℃ 避光保存，若已经变为灰绿色，则不建议继续使用；

2）96 孔板最边缘小孔中的水分蒸发很快，容易导致药物浓度变化，出现误差较大，建议边缘小孔用无菌 PBS 填充；

3）反应结束后需要完全弃去小孔中的液体，本方法中的建议是用移液枪吸取，也可以倒扣 96 孔板用吸水纸吸去液体，两种方法均须注意不要碰到小孔底的沉淀物。

对于未知药物，加入 MTT 前需确认该药物是否会与 MTT 反应，或本身具有较强的氧化还原性。如果该药物成分尚未得到明确鉴定，建议用 PBS 清洗 2~3 次后再补加培养基，之后再加 MTT 溶液。