MTT 法检测药物对贴壁细胞的半抑制浓度

MTT 又名噻唑蓝【3-（4, 5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2, 5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，中文名为 3-（4, 5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝】，是一种黄颜色染料，可用于检测细胞的存活和生长情况。

活细胞线粒体中（原核细胞则位于细胞膜上）的琥珀酸脱氢酶 （Succinate dehydrogenase） 能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 （Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜 （Dimethyl sulfoxide, DMSO） 能够溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在 490 nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与活细胞数成正比，可以间接反映活细胞的数量，定量评价供试药物的毒性。根据检测数据，计算可得供试药物对细胞的半抑制浓度。

广泛应用于药物对体外培养的细胞毒性的测定。

（1）实验器材：

2 mL 离心管、50 mL 离心管

96 孔细胞培养板、10 μL 移液枪

200 μL 移液枪、1000 μL 移液枪

10 μL 枪头、200 μL 枪头、1000 μL 枪头

CO₂ 细胞培养箱、生物安全柜、离心管架

恒温震荡摇床、石英比色皿、酶标仪

光学显微镜、多通道移液器（排枪）等

（2）试剂：

MTT、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS

DMSO 等。

（3）供试细胞和待测样品：

生长于对数期的细胞、待测药物

（1）配制 MTT 和梯度浓度的药物

a. PBS 磷酸缓冲液 （1 L，调节 pH = 7.4）

b. MTT （5 mg/mL）：称取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃ 避光保存；

c. 待测药物：称取约 0.5 mg 待测药物，用 DMSO 配成 2.56 mg/mL 的初始浓度，建议预实验稀释的系列梯度浓度分别为 2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL（该浓度范围针对本实验室初筛的药物活性所设，具体药物浓度请根据自身实际情况进行设立），后根据实验结果再选择更精细的浓度；硫酸链霉素的浓度与待测药物一致。

（2）细胞标准曲线制作：

a. 用 0.5% 的胰蛋白酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反应，1000 rpm 离心 5 min，弃上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，计数后调整细胞悬液的浓度至 5~10×10⁴/mL；

b. 向 96 孔板的小孔中加入 100 μL 细胞悬液，每板铺 8 组细胞，浓度设置分别为 3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000 个/孔（边缘孔用无菌 PBS 填充），共铺 4 板细胞；

c. 96 孔板放入 5% CO₂ 培养箱中，37 ℃ 培养，每 24 h 取出一块板进行检测：

1） 每小孔加入 10 μL MTT溶液，放回培养箱中继续培养 4~6 h；

2） 吸去小孔内培养液（移液枪不要触到底部的结晶）， 每孔加入 150 μL DMSO，摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解，之后用酶标仪检测各小孔在波长 490 nm 下的吸光值；

d. 绘制标准曲线：以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长的标准曲线。

（3）接入细胞：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度后，向 96 孔板中加入 100 μL 细胞悬液，铺板使细胞浓度为 1000~10000 个/孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）；

（4）共培养：96 孔板放入 5% CO₂ 培养箱中，37 ℃ 孵育至细胞贴壁后，加入一系列浓度梯度的药物，溶剂对照为 DMSO，选择相应已知活性良好的药物用作阳性对照，每个处理重复 3 次，继续培养 24~72 h 后显微镜观察；

（5）向 96 孔板的每个小孔中加入 20 uL MTT 溶液，继续培养 4 h 后观察显色情况，终止培养后，吸去小孔内培养液，每小孔加入 150 uL DMSO，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。

（6）半抑制浓度采用改良寇式法进行计算，公式：1 g IC₅₀ = Xm - I [P-（3 - Pm - Pn）/ 4]

Xm：1g 最大剂量

I：1g（最大剂量/相临剂量）

P：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

其中，最大阳性反应率是指最大抑制率，最小阳性反应率是指最小抑制率，药物抑制率 = 1 - 加药组 OD 值 / 对照组 OD 值，将所得数据代数计算即可。

1）MTT 建议现配现用，分装后 -20 ℃ 避光保存，若已经变为灰绿色，则不建议继续使用；

2）要保证初始的铺板密度一致，需要对细胞进行计数，根据计数结果，调整到铺板所需密度，本实验方法中给出的范围较大，不同细胞需要根据实际情况做出相应调整，同样地，起始药物浓度范围也需进行预实验判断；

3）96 孔板最边缘小孔中的水分蒸发很快，容易导致药物浓度变化，出现误差较大，建议边缘小孔用无菌 PBS 填充；

4）反应结束后需要完全弃去小孔中的液体，本方法中的建议是用移液枪吸取，也可以倒扣 96 孔板用吸水纸吸去液体，两种方法均须注意不要碰到小孔底的沉淀物。

对于未知药物，加入 MTT 前需确认该药物是否会与 MTT 反应，或本身具有较强的氧化还原性。如果该药物成分尚未得到明确鉴定，建议用 PBS 清洗 2~3 次后再补加培养基，之后再加 MTT 溶液。