🔥 乙酰化 RNA 的免疫沉淀

A-RIP 技术是利用抗体特异性识别并富集细胞中乙酰化 RNA，随后将其沉淀，分离纯化后可进行下一步的 RNA 测序和 RT-qPCR 等分析。

A-RIP 技术可以用于检测细胞中乙酰化 RNA 的种类和分布，筛选新的 RNA 乙酰化修饰底物和酶，以及探究 RNA 乙酰化修饰在基因表达调控、细胞分化和肿瘤发生等生物学过程中的作用。

细胞或组织样品

RNaseAWAY 去核酸酶污染清洗液

磷酸盐缓冲液（PBS）

细胞裂解缓冲液（lysis buffer，含有 0.5% NP-40 和 0.5% Triton X-100）

1 M 甲醛溶液、1.2 M 甘氨酸、25% 甲醛溶液

5 M 甘氨酸溶液、10% Triton X-100 溶液

10% NP-40 溶液、10% SDS 溶液

蛋白酶抑制剂

RIPA 缓冲液（含有 1% NP-40、0.5% deoxycholate、0.1% SDS、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCI，pH 8.0）

1% TritonX-100 缓冲液（含有 1% Triton X-100、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCI, pH 7.4）

ProteinA+G Agarose

Phenol：Chloroform [pH 4.5]、无水乙醇

0.3 M 醋酸钠，15 mg/mL 线性丙烯酰胺

RNase-free 蛋白酶K （50 mg）

RNA 酶抑制剂

1. 收集细胞或组织样品。用 RNase AWAY 清洗液去除污染物，然后用 PBS 洗涤 2~3 次目的：准备细胞或组织样品，去除外部的污染物。

2. 加入细胞裂解缓冲液（提前加好蛋白酶抑制剂和 RNA 酶抑制剂，裂解液体积根据细胞量加）。4 ℃ 裂解 10~15 min，随后将细胞裂解液在 4 ℃ 下 12000 rpm 离心 10 min。

目的：裂解细胞并去除细胞碎片和细胞核。

3. 用 1 M甲醛溶液进行交联。将细胞裂解液中的甲醛最终浓度调整为 0.1%。在室温下旋转混合 15 分钟。加入 1.2 M 甘氨酸溶液以停止交联反应。

目的：交联 RNA 和蛋白质。

4. 洗涤样品。用 PBS 洗涤细胞裂解液。

目的：去除未交联的甲醛。

5. 用 25% 甲醛溶液进行二次交联。将细胞裂解液中的甲醛最终浓度调整为 0.1%。在室温下旋转混合 15 分钟。加入 5 M 甘氨酸溶液以停止交联反应。

目的：加强 RNA 和蛋白质的交联。

6. 洗涤样品。用 PBS 洗涤细胞裂解液，以去除未交联的甲醛。

目的：去除未交联的甲醛。

7. 进行免疫沉淀。将 25% 乙酰化抗体加入至样品中，4 ℃ 下旋转混合过夜。再加入 ProteinA+G Agarose,并在 4 ℃ 下旋转混合 2 小时。用 PBS 洗涤免疫沉淀物。

8. 4 ℃，2500 rpm（约 1000 g）离心 5 分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉 Protein A+G Agarose。

9. 用 1% TritonX-100 缓冲液洗涤免疫沉淀物后，再用 RIPA 缓冲液洗涤免疫沉淀物，洗涤五次。

目的：去除非特异性结合的 RNA 和蛋白质。

10. 洗涤完后用 RNase-free 蛋白酶K（100 μl 体系）在 37 ℃ 消化 1 h。

目的：完全去除非特异性结合的蛋白质，同时将 Protein A+G Agarose 上结合的 RNA 洗涤下来。

11. 加入等量的 Phenol:Chloroform [pH 4.5]，混匀后 4 ℃ 离心 13000 rpm 15 min。

12. 取上清，加入三倍体积无水乙醇、0.3 M 醋酸钠和 15 mg/mL 线性丙烯酰胺沉淀过夜。第二天抽取乙酰化 RNA 进行下一步的测序或者 RT-qPCR。

1. 对于不同细胞类型和不同生长状态的细胞，RNA-抗体复合物的制备可能存在差异，需要进行优化；

2. RNA-抗体复合物的富集和纯化过程中需要进行多次洗涤，以去除非特异性结合的 RNA 和蛋白质，洗涤的缓冲液需要严格控制 pH 和离子浓度，以保证 RNA-抗体复合物的稳定性和特异性；

3. 选择合适的抗体对 RNA 进行富集，需要进行对照实验，排除非特异性结合的干扰；

4. 在 A-RIP 实验中需要使用无乙酰化 RNA 的对照组进行比较，以减少假阳性结果的误差。

5. 所有实验都最好在 4 ℃ 或者冰上进行，所有试剂都需要加 RNA 酶抑制剂防止 RNA 降解。