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🔥 最小抑菌浓度(MIC)测定——微量稀释法

相关实验:最小抑菌浓度(MIC)测定

别名:药敏试验,微量肉汤稀释法

最新修订时间:

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合作专家 | 张望博士

感染病学 浙江大学

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审核专家 | 张乐宜博士

临床医学 浙江大学

简介

最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)是指能够抑制微生物生长、繁殖的最低药物浓度。MIC 测试方法有很多种,常见的测试方法有如下三种:微量稀释法、琼脂稀释法、E-test 法。本次详细介绍微量稀释法。

原理

将抗菌药物与待测微生物在一定的稀释范围内进行培养,通常是在每毫升(mL)100 万个菌落形成单位(CFU)的悬浮浓度时,测定抗菌药物不同浓度下微生物的生长情况。由于微生物的存在,没有抗菌活性的测试体系会出现浑浊,而没有浑浊则表明待测微生物的生长受到了抑制。

用途

测定药物的最小抑菌浓度,评价药物的抗菌活性及抑菌能力。

材料与仪器

灭菌阳离子调节培养基 Mueller-Hinton Broth(CAMHB)

待测药物粉剂、待测菌株、灭菌生理盐水

灭菌双蒸水、固体培养基

无菌 V 型 / U 型底 96 孔培养板

麦氏浊度仪、灭菌塑料比浊试管

多道移液器

步骤

1. 提前将待测菌株接种于相应固体培养平板上,于 37 ℃ 细菌培养箱中过夜培养。

2. 分别称取适量待测抗菌药物粉剂,加灭菌双蒸水充分溶解,配制成贮存液备用。

3. 按实验需求,使用 CAMHB 液体培养基稀释贮存液至最高待测药物浓度,取无菌 96 孔板,在生物安全柜中进行药物稀释,具体操作为:

第一孔(A1)加入 200 μL 最高待测浓度药物,A2~A12 孔加入 100 μL CAMHB 液体培养基,随后从 A1 孔吸出 100 μL 加入 A2 孔,混匀后再从 A2 孔吸出 100 μL 加入 A3 孔,以此类推梯度稀释到 A12 孔,并舍弃最后 100 µL 稀释后的液体。

4. 在透明塑料试管中加入 1 mL 灭菌生理盐水;置于浊度仪上调零,随后挑取待测菌株充分溶于生理盐水,震荡混匀,调整浊度于 0.4~0.6 麦氏浊度(MCF)之间,继续用灭菌生理盐水稀释 20 倍备用。

5. 将 10 μL 稀释后的菌悬液依次加入每个浓度的药物孔(A1~A12)中;将 96 孔板置于 37 ℃ 细菌培养箱中培养 16~18 h。

6. 读取没有细菌生长的最低药物浓度,即为该细菌对该药物的最小抑菌浓度(MIC)。

7. 药敏试验以大肠埃希菌 ATCC25922 等标准菌株作为质控菌株,药敏判断标准参照 CLSI、EUCAST 指南。

注意事项

1. 每次实验时应根据待测菌的不同而分别选用:金黄色葡萄球菌 ATCC25923、大肠埃希菌 ATCC25922、粪肠球菌 ATCC29212 和铜绿假单胞菌 ATCC27853 等标准菌株在同一试验条件下作平行试验,常用抗菌药物对这些标准菌株的 MIC 应在预期值范围内。

表 1 质控菌株 MIC 范围 (mg/L)

2. 培养基要求是适合微生物生长,有些微生物对培养基中的成分有特殊的要求,要用特殊的培养基才能进行药敏试验:例如,流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用 HTM 琼脂;淋球菌的药敏试验培养基用加 5% 羊血的巧克力 MH 琼脂;肺炎链球菌的药敏试验用 MH 加 5% 的脱纤维羊血培养基。

3. 不同抗生素的稳定性不同,抗生素贮存液最好现配现用,或低温保存,若出现明显的状态变化,应重新配置。

4. 某些特殊药物需要根据药物性质预处理培养基以消除拮抗成分;如头孢地尔的药敏试验使用去除铁离子的 CAMHB。

常见问题

质控组的 MIC 不在预期范围内称为失控,常见的影响 MIC 测定结果的因素如下:


(1)培养基:培养基的 pH、渗透压及电解质对 MIC 有影响;  

(2)抗菌药物:抗菌药物必须采用标准粉剂。配好的药物原液应在有效期内使用;  

(3)结果观察时间:大部分微生物在 12~18 h 观察,有的病原微生物在 20~24 h 观察。培养时间过长,被轻度抑制的部分病原菌可重新开始生长;另外由于某些抗菌药物不够稳定,培养时间过长使其抗菌活性降低,甚至消失,从而使 MIC 值增高。

来源:丁香实验

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