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🔥 斑点免疫渗滤试验

相关实验:斑点免疫渗滤实验

别名:斑点金免疫渗滤测定实验,滴金法

最新修订时间:

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肿瘤学 北京协和医学院

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纳米生物医学 中国科学院大学

简介

一种利用抗原或抗体进行相应特异性免疫反应的检测实验,是目前即时检验(POCT)的主要方法之一。

原理

将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上,将膜贴于吸水材料上,依次在膜上滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂进行抗体或抗原反应,过量试剂很快渗入吸水材料中,通过渗滤逐步反应。

抗原抗体反应后,形成大分子胶体金复合物,从而得到阳性结果,即在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时,渗滤液中的抗原或抗体与膜上相应的抗体或抗原相接触,起到亲和层析的浓缩作用,从而达到快速检测的目的,同时洗涤液的渗入在短时间内可达到彻底洗涤的目的,简化了操作步骤。

用途

用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标记物,以及应用于检测尿液 HCG「金标」的早孕诊断试剂。

材料与仪器

① 蛋白质标准品或待检测的蛋白质

② 非特异性蛋白质结合剂(例如:牛血清白蛋白)

③ 洗涤缓冲液

④ 特异性抗体(一抗)或抗原

⑤ 检测二抗

⑥ 渗滤装置

⑦ NC 膜

⑧ 封闭液(0.2% BSA 和 0.05% 吐温 20 的洗涤液)

⑨ 金标抗体

步骤

1、渗滤装置:为一塑料小盒(4×3×0.6 cm),分为底、盖两层,盖的中央有一个直径 0.5 cm 的小孔。盒底充填吸水性较强的垫料,盖孔下紧贴垫料放置一片 NC 膜。紧闭盒盖,即为渗滤装置。在孔中的 NC 膜上点加 1~2 ml 特异性抗体(一抗)或抗原,室温自然干燥,保存于放干燥剂的密封塑料袋中备用。

2、取出渗滤器,先在小孔的 NC 膜上,滴加 2 滴(约 100 ml)封闭液;

3、待其渗入盒内,在 NC 膜上,加待检标本 1 滴(约 50 ml);

4、待其渗入盒内,在 NC 膜上,滴加 2 滴(约 100 ml)洗涤液;

5、待其渗入盒内,在 NC 膜上,加金标抗体 1 滴(约 50 ml),使其与 NC 膜上吸附的检品发生反应;

6、待其渗入盒内,在 NC 膜上,滴加 2 滴(约 100 ml)洗涤液;

7、至洗涤液完全渗入盒内。

预期结果:在小孔 NC 膜上出现红色反应时为阳性反应,阴性反应不着色。

注意事项

1、特异性抗体 (一抗) 或抗原、待检标本和金标抗体的用量事先都必须应用方阵法确定最适合用量。

2、盒底充填的垫料吸水性要强,否则可能影响结果。

3、斑点金免疫渗滤试验间接法测血清标本中抗体,导致假阳性结果的主要原因是血清标本中非目的 IgG 的干扰。

常见问题

质量控制:滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。夹心法的质控点最好是相应抗原,也可用 SPA 或针对金标抗体的抗抗体充当。间接法的质控点采用盐析法粗提的人 IgG 最为方便。

来源:丁香实验

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