🔥 固相抗体芯片

采用 Western Blotting，简称 WB，来检测蛋白表达水平在基础研究中最为常见。当面临多样本，或蛋白筛选工作时，这种传统方法会显得力不从心，需要大量的时间成本。

固相抗体芯片的设计和开发在很大程度上弥补了 WB 耗时长，单次检测样本少的缺点。它在细胞因子、分子通路等高通量筛选中发挥着极大的优势。

固相蛋白芯片的基本原理和 ELISA 极其类似，采用的是双抗体夹心免疫分析方法和原理。这种基于膜的抗体芯片，包含针对高达数百种分析物的捕获抗体，以双抗体的形式点在 NC 膜上。每块芯片都是为分析特定的蛋白家族或细胞因子家族而设计的。

高通量筛选。

这里我们用 2021 年 Natrue Communication 上发表的 High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance（Nat Commun. 2021 Jan 11;12（1）:213. doi: 10.1038/s41467-020-20500-w）文献来详细介绍固相蛋白芯片的用途，话不多说，直接上图：

作者用到胰岛素抵抗模型的小鼠，在接受瘦动物分泌的外泌体（lean animals exosome，L-Exo）或肥胖动物（obese animal exosome，H-Exo）治疗后，14 天的小鼠的各种血浆细胞因子表达变化情况。
这里作者在不知道这些外泌体治疗能够对胰岛素抵抗的小鼠的血清细胞因子水平带来何种影响时，我们的常规思路可能就是通过 ELISA 或者 WB 来进行检测，但这需要多少细胞因子的试剂盒和多少 WB 所用的抗体，以及多少时间成本？但使用固相蛋白芯片就完美解决了这一高通量检测的需求，一个下午的时间，完美解决问题。

图（左）在经过 H-Exo 及 L-Exo 治疗后，表达量大于 2 倍的细胞因子展示。红条显示已知与胰岛素抵抗有关的细胞因子/因子。图（右）血浆中的 TNF-α和 IL-6 在用 H-Exo 治疗后显著上调。
细心的同学们可能已经观察到了，这个实验展示了三张芯片，分别是 PBS、L-Exo 及 H-Exo 处理。统计的话先展示了 H-Exo vs L-Exo，确定了 top 变化倍数且与研究疾病通路相关的细胞因子后，再进行具体的三者统计比较。先粗筛看大体趋势，再细品统计学差异。

待检测的样品（血清/血浆样品、提取好蛋白的组织样品等）、蛋白芯片检测试剂盒（一般包含抗体膜、标记抗体、显色底物等）、荧光发光或化学发光设备。

1、将制备的样品与抗体膜共孵育，具体剂量和孵育时间，不同的试剂盒会略有不同。

2、将膜与标记抗体（结合 HRP 的标记抗体或者荧光素偶联的标记抗体）共孵育，具体孵育时间可参考具体试剂盒要求。

3、将膜与显色底物共孵育（荧光标记抗体忽略此步骤）。

4、使用发光液激活显色底物（荧光标记抗体忽略此步骤）。

5、将膜进行化学发光或荧光发光。

6、调整合适对比度及亮度，出图。

7、半定量分析、统计蛋白表达水平。

1、蛋白质或血清样本检测一般需要至少 3 个独立样本才能进行统计分析，购买试剂盒时需要注意，一个因子或蛋白是否有三个重复结合位点，如果一张膜是 2 个，则需要再进行一次实验，得到 4 个独立样本进行统计分析。
2、在进行高通量筛选后，如果符合实验预期，筛选出的个别蛋白还可以进行 WB 或 ELISA 进行进一步验证。

1、曝光显示膜背景过高怎么办？

这时候需要调整曝光时间，适当减少曝光时间，必要时可对膜进行适当清洗后再曝光

2、想要检测的目的蛋白没有检测到怎么办？

这时首先需要观察整张膜中，其他蛋白表达情况，如果整张膜蛋白表达都很低，可以适当增加蛋白的上样量再进行检测。如果其他蛋白有相对较高的表达，基本上可以排除上样量的问题，这时需要回忆整个操作过程中有无疏漏具体环节，包括样本提取过程以及动物模型制备过程等。