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🔥 慢病毒转染过表达细胞系

相关实验:细胞转染

别名:Overexpression of cell line by lentivirus transfected

最新修订时间:

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合作专家 | 孙齐博士

生理学 首都医科大学

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生理学 大连医科大学

原理

外源基因导入细胞,根据其在细胞内表达方式的不同分为瞬时表达和稳定表达两大类。瞬时表达时外源的 DNA/RNA 不会整合到宿主细胞染色体中,持续时间短,一般 96 h 即失效;稳定表达时外源 DNA 会整合到宿主细胞染色体中,细胞可稳定长期表达目的基因,应用广泛。鉴于慢病毒几乎可以感染所有类型的细胞,且感染后易于整合到宿主细胞的基因组中,长时间稳定表达,因此应用「慢病毒感染—药物筛选法」构建稳转细胞株,成为构建稳转细胞株的主流方法,已被医学研究领域广泛采用。

材料与仪器

DMEM 培养基、无菌 PBS

移液器、无菌枪头、6 孔细胞培养板

包被好的慢病毒悬液、嘌呤霉素(根据抗性标签决定药物选择)

步骤

(1)处理细胞,将细胞接种于 6 孔板中,密度 30~40%;

(2)置于细胞培养箱培养 16~20 h,PBS 润洗,更换 1 mL 新鲜培养基;

(3)滴加 1 mL 相应的病毒悬液(对照病毒/过表达目的病毒);

(4)置于细胞培养箱,孵育 24 h,PBS 润洗,更换 1 mL 新鲜培养基;

(5)置于细胞培养箱,孵育 48 h,使用已经确定的细胞最低致死浓度嘌呤霉素进行筛选;

(6)连续培养 1~2 周后,常规消化传代,嘌呤霉素连续筛选,得到过表达稳转细胞系。

注意事项

(1)实验前 30 min 对细胞间及超净台进行充分紫外照射;

(2)进入细胞间更换无菌衣,无菌拖鞋等;

(3)保证细胞接种密度 30~40%,便于后续转染操作;

(4)确定嘌呤霉素最低致死浓度时,将细胞以 40~50% 的密度接种于 6 孔板,置于细胞培养箱过夜培养。次日待细胞贴壁后,PBS 润洗,分别更换含嘌呤霉素的新鲜培养基(终浓度为 0、0.5、1、2、4、8 µg/mL)。细胞培养箱孵育 48 h 后观察细胞状态及死亡情况,确定嘌呤霉素的最低致死浓度,用于后续稳转细胞系筛选。

来源:丁香实验

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