🔥 慢病毒转染过表达细胞系

外源基因导入细胞，根据其在细胞内表达方式的不同分为瞬时表达和稳定表达两大类。瞬时表达时外源的 DNA/RNA 不会整合到宿主细胞染色体中，持续时间短，一般 96 h 即失效；稳定表达时外源 DNA 会整合到宿主细胞染色体中，细胞可稳定长期表达目的基因，应用广泛。鉴于慢病毒几乎可以感染所有类型的细胞，且感染后易于整合到宿主细胞的基因组中，长时间稳定表达，因此应用「慢病毒感染—药物筛选法」构建稳转细胞株，成为构建稳转细胞株的主流方法，已被医学研究领域广泛采用。

DMEM 培养基、无菌 PBS

移液器、无菌枪头、6 孔细胞培养板

包被好的慢病毒悬液、嘌呤霉素（根据抗性标签决定药物选择）

（1）处理细胞，将细胞接种于 6 孔板中，密度 30~40%；

（2）置于细胞培养箱培养 16~20 h，PBS 润洗，更换 1 mL 新鲜培养基；

（3）滴加 1 mL 相应的病毒悬液（对照病毒/过表达目的病毒）；

（4）置于细胞培养箱，孵育 24 h，PBS 润洗，更换 1 mL 新鲜培养基；

（5）置于细胞培养箱，孵育 48 h，使用已经确定的细胞最低致死浓度嘌呤霉素进行筛选；

（6）连续培养 1~2 周后，常规消化传代，嘌呤霉素连续筛选，得到过表达稳转细胞系。

（1）实验前 30 min 对细胞间及超净台进行充分紫外照射；

（2）进入细胞间更换无菌衣，无菌拖鞋等；

（3）保证细胞接种密度 30~40%，便于后续转染操作；

（4）确定嘌呤霉素最低致死浓度时，将细胞以 40~50% 的密度接种于 6 孔板，置于细胞培养箱过夜培养。次日待细胞贴壁后，PBS 润洗，分别更换含嘌呤霉素的新鲜培养基（终浓度为 0、0.5、1、2、4、8 µg/mL）。细胞培养箱孵育 48 h 后观察细胞状态及死亡情况，确定嘌呤霉素的最低致死浓度，用于后续稳转细胞系筛选。