动物发光标记法

活体生物发光成像技术的原理：在小型哺乳动物体内利用报告基因（荧光素酶基因）表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg²⁺ 存在的条件下消耗ATP发生氧化还原反应，将部分化学能转化为可见光能释放。因此只有在活细胞内才会发生发光现象。并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。

实验动物：裸鼠

试剂和耗材：DMEM 培养基、胎牛血清、胰酶、荧光素底物、紫杉醇注射液

仪器：动物活体成像系统

一、材料准备

1. 动物：裸鼠 9 只，6～8 周龄，雄性；C57 小鼠24 只，6～8 周龄，雄性；动物均为自由饮水采食。
2. 细胞：MDA-MB-231 人乳腺癌细胞系，使用荧光素酶基因标记。方法：用荧光素酶报告基因标记的质粒转染人乳腺癌细胞，共转染的还有选择性标记基因，从而保证转染细胞的稳定性，形成表达荧光素酶的肿瘤细胞株；B16 黑色素瘤细胞。

二、实验步骤

1. 紫杉醇混合胶束的制备

（1）将适量紫杉醇(Taxol)溶解在少量无水乙醇和丙二醇的混合溶剂中.

（2） 加入适当比例的磷脂和表面活性剂 A 进行充分混合，制得稳定的紫杉醇混合胶束前体制剂(PMM)，载药浓度为 6 g/L。

（3）临用时按剂量加入生理盐水中稀释、摇匀后即可使用。制剂体系的粒径大小与分布特征采用动态激光光散射粒度仪检测。

1. MDA-MB-231 人乳腺癌细胞荷瘤鼠模型的建立

（1）培养荧光素酶基因标记的 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞系，使用 DMEM 培养基（添加 10% 胎牛血清），37℃、5% CO₂ 培养箱中培养，每 3 天传代 1 次。

（2）待细胞密度为 80%～90%、细胞总量达到实验所需要求时，使用胰酶消化，收集于 PBS 溶液重悬。

（3）如有需要，在细胞培养一定时间后，应使用抗生素进行抗性筛选，保证荧光素酶基因的表达量足够。

（4）收集细胞，使用 PBS 稀释至细胞数 1.5×10⁸/mL，接种于裸鼠腋下，每只裸鼠的接种量为 0.1 mL。

1. 动物活体成像检测

（1）接种后将裸鼠随机分为 3 组，分别为生理盐水组、紫杉醇注射液组、紫杉醇混合胶束制剂组，每组 3 只。

（2）肿瘤接种后第 8 天开始给药，剂量为 15 mg/kg，每 3 天腹腔注射给药 1 次。从第 1 次给药开始，每 7 天进行 1 次活体成像检测。

（3）采用戊巴比妥对裸鼠进行麻醉（剂量为 60~80 mg/kg），10~15 min 后裸鼠即处于昏迷状态。

（4）腹腔注射荧光素底物（150 mg/kg），发射光波长在 540~600 nm。注射后 10 -20min 观测，为荧光强度最高的时段。

1. 活体成像仪参数设置

（1）将 3-5 只小鼠并排放入暗室中，荧光素酶与底物反应后产生的发光不需要激发，可以自发光，只需调整 CCD 相机的曝光时间和 Binning 值拍照即可。

（2）曝光时间推荐选自动，使用软件 AniView 处理图像，增加伪彩。

（3）观察肿瘤区域的影像，并根据活体成像图片测量图中肿瘤大小，进行统计分析。

1. 在整个实验过程中，给药的同时监测裸鼠体重，采用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并与活体成像结果进行比较，考察紫杉醇制剂的抑瘤效果以及利用活体成像方法评价药物抑瘤作用的可行性和准确性。

1. 生存周期的测定

（1）在活体成像实验的基础上，研究不同紫杉醇制剂对 B16 黑色素瘤 C57 小鼠的生存期的影响。

（2）首先培养 B16 黑色素瘤细胞，以 PBS 调整细胞数至 5×10⁶/mL。采用右后肢皮下注射，每只 C57 小鼠注射 0.1 mL，即细胞数为 5×10⁵。

（3）接种后常温下正常饮食饲养，于肿瘤接种后第 6 天，肿瘤直径达 0.2 cm 左右时，随机将 C57 小鼠分成 3 组，分别为生理盐水组、Taxol 组、PMM 组，每组 8 只。

（4）采取腹腔注射给药法，每隔 3 天给药 1 次，给药剂量为 15 mg/kg。

（5）每天观察小鼠，以天为单位记录死亡时间并绘制生存周期曲线，并计算平均生存周期。

1. 统计学方法所有统计的实验数据以 x±s 表示，采用 SPSS 软件对比较的样本进行 t 检验。

一、讨论

基于生物发光原理的活体动物肿瘤成像技术方法，能准确标记和得到边界清晰的实时在体肿瘤影像，可以有效解决染料荧光标记技术特异性差、干扰信号强、局域信号不明显等缺点。

作为一种新兴发展的实时、在体和无创伤监测技术，其安全性、实时性、准确性等方面具有较大的优势，能够为药效动物实验研究与评价提供更科学准确的依据。

当然，活体动物成像技术的应用还存在许多不足和困难，如本文由于使用仪器配置所限，采用的是二维活体成像系统，若采用三维活体成像系统获得活体肿瘤三维立体图像，则能够获得更多关于肿瘤形态大小等的信息。

另外，目前具有生物发光特征的细胞品系种类较少，一般是根据需要自制细胞，制备技术过程复杂，成本较高，因此需要建立不同肿瘤模型时存在困难，限制了该方法的应用范围。

紫杉醇是目前临床上广泛使用的一种抗肿瘤药物，其溶解度较低市售紫杉醇注射液是采用聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和无水乙醇为溶剂制成，其主要问题是Cremophor EL带来的严重过敏反应和神经毒性等。

本文采用磷脂和一种新型的表面活性剂制成混合胶束系统，可有效解决紫杉醇的溶解性问题，并且避免Cremophor EL的毒性问题。

从给药后的活体动物成像结果可见：Taxol和PMM制剂均可有效抑制肿瘤生长，但两者并无显著性差异；但从给药后裸鼠体重变化以及状态可见，混合胶束组裸鼠进食和活动正常，体重比较稳定，而Taxol组裸鼠状态萎靡不振，进食较少，体重有所下降。

这些结果表明，与Taxol相比，PMM制剂在一定程度上提高了裸鼠对药物的顺应性，不良反应有所降低；进一步的生存周期实验结果也表明，Taxol和PMM制剂提高了C57荷瘤小鼠的存活时间，同时给予PMM的C57荷瘤鼠平均生存周期更长。

分析PMM制剂的抑瘤效果以及提高生存周期的原因，可能是PMM中磷脂的存在会使胶束自发地形成药物脂质纳米粒，而改变药物的体内分布特性，使其更好地发挥药效；同时所采用的新型表面活性剂能够降低组胺释放，从而降低制剂的毒性，提高药物的安全性。