审核专家 | 张旭娟博士
生物医学工程 北京工业大学
原理
高尔基染色包括银 Golgi 染色和汞 Golgi 染色技术。
银 Golgi 染色原理：
浸泡脑组织的重铬酸钾溶液与硝酸银溶液发生反应，生成黑色的铬酸银沉淀，由于组织的嗜银性而沉积于神经细胞中。银高尔基技术主要有两种被广泛应用：快速 Golgi 法和 Golgi- Kopsch 法。
汞 Golgi 染色原理：
由于银 Golgi 染色存在一定缺陷，Cox 对高尔基技术进行改进，被称为 「Golgi-Cox 法」。使用重铬酸钾和氯化汞的混合物，并加入铬酸钾来调节溶液酸性的反应。Golgi-Cox 染色的化学性质尚未完全了解；Golgi-Cox 浸渍的神经细胞在碱化作用下形成的黑色沉积物被认为是黑色硫化汞和一些金属的复杂氧化物。
用途
高尔基法能够发现动物大脑的神经细胞因药物处理或神经系统疾病引起的树突和树突棘微小形态改变，观察神经发育，死亡，传递等方面区别。如阿尔茨海默病检测脑组织神经细胞形态改变记忆学习记忆的影响。
尼氏染色法（Nissl staining）：
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优点： 操作简便，实验成本低； |
不足： 中脑对神经元进行数量统计，观察是否有神经元丢失。不能观察树突或树突棘的变化。 |
材料与仪器
仪器：
3D 扫描仪扫描或正置显微镜（含拍照系统）
材料：
动物及死后人类脑组织
4%（w/v） 多聚甲醛、异戊烷、干冰
丙烯基紫罗兰溶液
50%/75%/95%/100% 乙醇、二甲苯
封片剂、刀片、染色缸、低温保持器
凝胶涂层显微镜载玻片、吸管、滤纸
盖玻片、FD 快速高尔基染色试剂盒
步骤
本次实验步骤以优化的 Golgi-cox 技术为例：
1. 提前 24 h 将试剂盒中的溶液 A 和 B 混匀；
2. 将小鼠脑组织取出后用干净的 PBS 冲洗后，置于 A 和 B 的混合液中，在室温下避光保存。浸泡 6 h 以后或次日更换新的浸渍液，在室温下避光保存 2 周（每个脑组织至少用 2 mL浸泡液）；
3. 将组织转移到溶液 C 中，浸泡 24 h 后或次日更换新的 C 液，在室温下避光保存 7 天；
4. 振动切片机将脑组织制备成以 100~200 μm 厚度的切片，把样本转移到含有溶液 C 的明胶包被的显微镜载玻片上，并在室温下干燥 3 天；
5. 用蒸馏水冲洗玻片两次，每次 4 min；
6. 根据溶液 D、溶液 E 和水为 1:1:2 的比例进行配置混合液（现用现配），将玻片置于混合液中 10 min。用蒸馏水冲洗玻片两次，每次 4 min；
7. 在 50%、75% 和 95% 的乙醇中对切片进行脱水，每个浓度梯度脱水 4 min；
8. 然后将切片置于无水乙醇中进行脱水，4 次，每次 4 min；
9. 将切片在二甲苯中透明，3 次，每次 4 min；
10. 用封片剂封片；
11. 通过 3D 扫描仪扫描仪或正置显微进行图像采集，选择第二或第三级树突进行定量分析，通过 Image J 软件计算树突棘数量。
注意事项
1. 本实验样品使用新鲜或短期固定的脑组织。不推荐使用已经进行福尔马林固定或新鲜冷冻的脑组织；
2. 对于体积较大的脑部样本（如大鼠脑组织）需用锋利的刀片切成大约 10 mm 厚的块状；
3. 溶液 A 和溶液 B 的混合液至少提前 24 h 配制且不能搅拌；
4. 步骤 2 中，在脑组织浸泡期间每周两次对装有组织的容器可轻轻地左右旋涡（一定不要晃动！） 几秒钟；
5. 溶液 A 和 B 含有重金属，接触皮肤是有毒的， 如果吞咽可能是致命的。 实验操作时，一定要穿戴防护服、手套等防护用具，在化学通风橱中完成。溶液 A 和 B 的废弃物要专门收集起来，统一由专业部门处置；
6. 用 Golgi 染色的切片应避光保存。
常见问题
1. 背景颜色深：
可能原因是溶液 A 和 B 没有提前 24 h 配置或脑组织在 A 和 B 混合液中浸泡时间过长，超过 14 天。
2. 出现阴性结果：
可能是因为将动物进行灌注后再取脑进行实验。
3. 高尔基染色不深：
可能原因脑组织在 A 和 B 混合液中染色时间完全不足 14 天或是因为液体太少没有完全浸润脑组织或是试剂过期。
来源：丁香实验
