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蛋白质乙酰化

相关实验:翻译后修饰蛋白质的定性和定量实验

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审核专家 | 赵玉洁博士

生理学 厦门大学

原理

乙酰化修饰是蛋白翻译后修饰方式之一,主要分为两类:蛋白赖氨酸上的乙酰化修饰和蛋白 N 端的乙酰化修饰,通常是在乙酰基转移酶的催化下,蛋白在转录过程中或转录后发生的修饰,参与了基因表达调控、细胞代谢、蛋白质稳定等机体多种生理病理过程,蛋白质乙酰化位点的鉴定和分析已成为蛋白组学研究的重要组成部分。

用途

蛋白乙酰化状态的分析和乙酰化位点的鉴定

Western blot

利用特异的乙酰化抗体检测常规样品中的乙酰化蛋白。

质谱

复杂蛋白混合物中大规模乙酰化蛋白的分析、乙酰化位点的鉴定。

材料与仪器

1、材料与仪器见 Western blot;

2、质谱-蛋白酶;乙酰化抗体;高级液相色谱仪;质谱仪。

步骤

1、步骤见 Western blot;

2、质谱:

① 细胞或组织蛋白抽提;

② 凝胶或溶液内蛋白酶切;

③ 乙酰化肽段富集(乙酰化抗体);

④ HPLC 肽段分离;

⑤ 串联质谱分析;

⑥ 乙酰化位点数据分析

注意事项

质谱:

1、PVDF 或者 NC 膜上的蛋白不能进行质谱检测;

2、对于临床病理样本,基于同一样本来源的生物学重复无法实现时,合理大量的生物学样本是必须的。

常见问题

质谱:

1、用于质谱检测的蛋白溶液中蛋白量的要求 混合蛋白溶液蛋白总量最好不少于 50 μg;

2、用于质谱检测的蛋白溶液样品溶剂要求 SDS 含量低于 0.1%;

3、纯化后蛋白可以直接使用蛋白溶液进行检测吗?

不可以,抗体纯化蛋白未经过 SDS-PAGE 分离,抗体会发生干扰。

来源:丁香实验

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