简介
流式细胞术 DNA 含量检测提供了一种快捷和可信的 DNA 倍体和肿瘤标本中细胞增殖分数分析方法。保存的和新鲜的标本都适用于该技术，在肿瘤的早期阶段，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和膀胱癌，其所获得信息可以与传统的预后因素联合对这些肿瘤做出生物评价。
原理
实体瘤 DNA 含量分析的基本原理是基于利用流式细胞术检测 DNA 倍体状态的信息和细胞增殖部分可以客观反映亚细胞显微特征，这些指标可以用于人肿瘤的生物学评价。
材料与仪器
器材：
① 流式细胞仪
② 离心机
试剂：
① 0.5 mg/ml 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）；
② 1 mg/ml 核酸酶 A（RNase）；
③ PBS；
④ 0.25％ 胰酶、0.5％ 胃蛋白酶；
⑤ 0.05 mg/ml 的胃酶抑素 A；
⑥ Histo-Solv X 或二甲苯替代品（Curtin Matheson Scientific，休士顿，德得克萨斯州）。
步骤
实体瘤 DNA 含量分析的基本过程可分为如下几步：
1 为 PI 染色准备新鲜固定细胞
1.1 将组织放入 60 mm × 15 mm 培养皿中。加 2 ml 新鲜的细胞培养液或 PBS。
1.2 用 21 号手术刀片将组织切削成适宜的碎片。用 500 μm 不锈钢网过筛组织。
1.3 将细胞悬液经 35 μm 尼龙网（Small Parts，迈阿密湖，佛罗里达州）过滤后，转到新的试管中。
1.4 加 3 ml PBS，并用微量加样器混匀。
1.5 将细胞用台式离心机 500 g 离心 5 min，去除上清液。
1.6 用 3 ml PBS 重悬细胞并混匀，重复步骤 5。
1.7 用 1 ml PBS 重悬细胞，并用 35 μm 尼龙网过滤。
1.8 细胞计数，用 3 × 105 细胞准备用细胞离心甩片机做细胞离心甩片。
1.9 将剩下的细胞悬液 500 g 离心 5 min，去除上清液。
1.10 将细胞轻轻地重悬于 1 ml 0.9％ 生理盐水中。
1.11 在用混悬器低速混合时加 2.5 ml 的 95％ 冷乙醇。将样本放置于 4 ℃ 至少 1 h，直至准备好流式细胞仪分析。
1.12 对于每个样品按下述准备两管：
管 1 = 患者细胞
管 2 = 患者和正常淋巴细胞 1：1 混合细胞。
1.13 将总数为 1 × 106 经 70％ 乙醇固定的细胞分装入合适的试管中。
1.14 加入 3 ml PBS，500 g 离心 5 min，去除上清，重复 1 次。
1.15 将细胞重悬于 800 μl 的 PBS 中。
1.16 加入 70 μl RNA 酶和 50 μl 的 PI，37 ℃ 水浴孵育 20 min。
1.17 样品用 35 μm 尼龙网过滤，置于冰上。
2 归档样品制备：石蜡包埋组织
2.1 初期准备
2.1.1 每个样品准备一支 16 mm × 100 mm 的硼硅试管和两支 12 × 75 mm 塑料试管。在试管上方系标签作为标记。
2.1.2 每个石蜡块切 1 至 3 张 50 μm 切片，切片的数量取决于组织的内容物。蜡块应放置于室温。
2.1.3 将切片放入 16 mm × 100 mm 试管中，小心操作防止切片碎裂。
2.1.4 试管可以密封，储存于 22 ℃ 至标本处理。
2.2 第 1 天
用下列溶液加满试管覆盖组织切片，直接孵育。在孵育结束时，尽可能多地不间断地吸取溶液，使得组织切片留在试管底部。
2.2.1 Histo-Solv X 或二甲苯替代品，处理 3 次，每次 15 min。
2.2.2 加无水乙醇，处理 2 次，每次 10 min。
2.2.3 95％ 乙醇，处理 2 次，每次 10 min。
2.2.4 80％ 乙醇，处理 2 次，每次 10 min。
2.2.5 70％ 乙醇，处理 2 次，每次 10 min。
2.2.6 加满 50％ 乙醇，处理过夜。
2.3 第 2 天
2.1 准备胃蛋白酶。使用前将事先溶解的胃蛋白酶置于 37 ℃ 水浴孵育 30 min。
2.2 从试管中吸去乙醇。
2.3 将组织切片重悬于 PBS 中再水化 10 min。500 g 离心 5 min。重复 1 次。
2.4 移去 PBS，加 2.5~3 ml 预温的胃蛋白酶。
2.5 将试管置于 37 ℃ 水浴孵育 20~45 min。
2.6 用 3-cc 注射器和 18 号针头吹打组织切片和胃蛋白酶，用力吹打 1 到 2 次。
2.7 加 175 μl 胃酶抑素 A 于试管内搅拌混匀。置试管于冰上。
2.8 500 g 离心 5 min。
2.9 用 2~3 ml PBS 重悬，离心。去除上清，再重复本步骤。
2.10 用 35 μm 尼龙网过滤，转入干净的 12 mm × 75 mm 塑料试管中。
2.11 细胞计数，将细胞浓度调整为 1 × 106/ml。
2.12 将 900 μl 细胞悬液转到第 2 个 12 × 75 mm 塑料试管中，并加 100 μl 预温的 RNA 酶，37 ℃ 水浴孵育 30 min。剩余的细胞悬液置于 - 20 ℃ 储存。
2.13 加 50 μl 的 PI，至试管于冰箱 30 min 或冰上。
3 分析
3.1 仪器操作和数据采集：调节流式细胞仪以蓝光为激发光，红色滤光片检测。PI 采用 488 nm 激光激发，发射光谱可用＞610 nm 长波滤光片检测。仪器的检测操作按照厂方操作规程进行，要强调的是每天要采用校准颗粒（珠）对仪器进行校准，使得在检测通道上获得一致分辨力和检测峰。光电倍增管（PMTs）的线性要每月检查 1 次。检测方法要事先构架好，采集前向散射光、DNA 峰、荧光信号的整体和宽度以确定分裂期细胞的 G2/M 期。
3.2 对照：对于新鲜的实体瘤分析，采用正常的外周血淋巴细胞（normal peripheral blood lympho-cytes，NPBLs）作为生物对照来评价 PI 染色质量和检测通道上二倍体细胞 G0/G1 期的一致性。检测要在等量的肿瘤细胞和正常对照细胞悬液混合后进行；肿瘤细胞可以用倍体数来评价。
3.3 测定：DNA 指数和细胞周期数据可以通过商业软件或手工获得。手工分析时，可以把光标区域设定在 G0/G1，峰和 S + G2/M 面积。DNA 指数的计算，是将检测通道上 G0/G1，异倍性峰值（x 轴）除以检测通道上内参 G0/G1，二倍体峰值。根据定义，二倍体 DNA 指数（DNA index，DI）应该等于 1.00。S 或者 S＋G2/M 的细胞周期分析通常使用各个细胞周期间隔的细胞量（面积）除以细胞总数来计算。
来源：丁香实验
