丁香实验_LOGO丁香通
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

单核甘酸多态性PCR

相关实验:单核甘酸多态性 PCR

别名:SNP-PCR

最新修订时间:

简介

单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP), 是美国MIT人类基因组中心负责 人Lander E S等人于1996年发现的新一代遗传标记,它主要是指在基因组水平上由单个核苷酸 的变异所引起的 DNA序列多态性,即指基因组内特定核苷酸位置上,存在两种不同的核苷酸, 且其出现的频率大于1% , 如果出现频率低于1%,则看作点突变。它是人类可遗传的变异中 最常见的一种,占所有已知多态性的90% 以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500〜 1000 个碱基对中就有1个,估计其总数可达300 万个甚至更多。
由于遗传密码中包含了大约300 万个差异,这些差异导致了人类基因组中存在广泛的多态 性,这种多态性可能由RFLP引起,也可能是 SSR造成,而90% 的差异是由SNP造成的。因 此,作为第三代遗传标记的单核苷酸多态性(SNP)的研究就显得尤为重要。
SNP所表现的多态性只涉及单个碱基的变异,这种变异可以是转换(C-T, G-A), 也可以 是颠换(C-A, G-T, C-G, A-T), 也可由单个碱基的插入或缺失所导致。但大多数是转换,具 有转换型变异的 SNP约占2/3, 其它几种变异的发生概率相似。 SNP在CG序列上出现最为频 繁。而且多半是C转换成T, 因为人类基因组中大多数的二核苷酸CpG的胞嘧啶是甲基化的,C 常自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶T残基。
在基因组 DNA中,SNP既可以发生在非编码序列中,也可以分布在编码序列中。编码序列 中的 SNP称之为cSNP (coding SNP, cSNP) , cSNP根据是否改变编码产生的氨基酸,可进一步 分为「非同义的」和「同义的」,cSNP中约有一半为非同义cSNP。SNP在整个基因组中的分布 密度是不同的,基因组平均变异数是相似的,大约每1330 个碱基对中就有1个 SNP存在,人类 300 万个左右的 SNP中有142万多个 SNP已在基因组范围的图上进行了标记。在包含基因的 区域里估计每1万个碱基中有8个,另外,常染色体与性染色体中的 SNP 分布密度是不同的, 个体中常染色体的差异是很小的。差异数目从每1万个碱基5.19个(第21号染色体)至每1万 个碱基8.79个(第15号染色体)不等;人类在性染色体上的差异更小,X染色体之间的差异大 约是每1万个碱基有4. 69个,Y染色体的差异更小,是每1万个碱基有1. 51个。总的来说,位于编码区内的 SNP比较少,因为在外显子内其变异率只有周围序列的1/5。但它在遗传性疾病 研究中却具有重要意义。因此对cSNP 的研究更受关注。
由于每个SNP 位点通常仅含2种等位基因一一双等位基因(diallele),就单个SNP而言只有 两种变异体,变异程度低于微卫星DNA , 但SNP在整个基因组中数量巨大、分布密集,因此就 整体而论,SNP 的多态性要高得多。而且由于 SNP是二态的,在基因组中筛査SNP往往只需+/ -分析,易于自动化批量检测,因而被认为是新一代的遗传标记。

原理

根据实验方法不同,对应的原理也有所不同,但操作方法一致:

1 . 引物延伸法

(1)质谱检测法[图13-6(a)]这种方法是利用一个引物在SNP±游一个碱基位点退火延 伸时结合ddNTP。延伸产物被质谱检测,延伸产物的质量不同,引物识别掺入的核昔酸并确定 SNP基因型。

(2)毛细管电泳法荧光检测[图13-6(b)]这种方法是利用引物在延伸SNP上游的碱基位 点时,延伸产物ddNTP带有不同的荧光标签。毛细管电泳后通过荧光检测产物,根据染料的颜 色指示掺入碱基的种类,从而达到 SNP基因分型。

(3)等位基因特异性引物检测 PCR 产物[图13-6(c)]这种方法是利用两个等位基因特异性 引物在延伸时,它们的3'末端在SNP位点,和一个普通的反向引物共同进行PCR 反应。这个反应 只在正向引物的3』末端能完全延伸到SNP位点,反应才会发生,根据PCR 的产物能推测基因型。

2. 特异探针杂交法

(a)探针阵列的靶位点杂交°这种方法是利用带标签的等位基因特异性探针结合在杂交的 SNP 的 靶位点固体表面。清洗表面去除错误配对的靶目标,而完全配对的靶目标和探针就能通过荧光被 检测,以达到基因分型。(b)TaqMan微阵列。这个阵列是利用两个等位基因特异性探针携带不 同的报告基因和猝灭剂染料在探针的一端,在错配对的 SNP位点。正确配对的探针在 PCR 扩增 SNP包含区时离开,释放它的报告基因,荧光检测确定SNP。基因型如图13-7所示。

3. 核昔酸连接法 (图13-8)

(1) 用CFET标签检测 这种方法是使用两个带有不同CFET标签的等位基因特异性探针和 一个带有生物素标签的普通探针,与邻近的序列杂交。如果在SNP位点正确配对,等位基因特 异性探针连接普通探针,反之,不连接。通过普通探针的生物素标签和来自CFET标签的荧光信 号来确认连接法,进而确定SNP基因型。

(2)挂锁探针的连接法 这种方法是使用两个等位基因特异性探针与目标DNA杂交, SNP位点处它的末端与邻近的序列杂交成一环形。如果正确配对,则探针的一个末端即特异 性等位基因与另一端连接,形成环形。可以用一种特殊引物通过滚环扩增检测,经过凝胶电 泳分析产物。

4. 酶切法(图13-9)

(a)限制性核酸内切酶酶切。这种方法是用一种限制性酶只酶切一种等位基因。限制消化的产物在 凝胶上检测,根据不同大小的片段数量推测 SNP基因型。

(b)入侵试验。这个试验是使用两个等 位基因特异性探针携带不同的报告基因和猝灭剂染料在它的任一末端,还有一种普通入侵探针。等 位基因特异性探针和入侵探针杂交,在目标DNA上在SNP位点处形成一个三维结构,可以被分裂 酶识别。在等位基因特异性探针和SNP位点完全结合时内切酶酶切三维结构并释放报告基因染料, 通过检测荧光也可以确定SNP基因型。

材料与仪器

器材:ABI PRISM 310、ABI PRISM 3100 遗传分析仪,ABI PRISM 373 或 AB1 PRISM 377 DNA 测序仪、PCR 扩增仪。

试剂:

①模板:基因组 DNA;

②2XTaqMan Universal PCR Master Mix 试剂盒

③40 X TaqMan SNP Genotyping Assays 试剂盒

④Tag DNA 聚合酶。

⑤高压灭菌去离子水。

⑥用于琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳的试剂。

步骤

单核苷酸多态性PCR 的基本过程可分为如下几步:
1.DNA 的提取
在法医的物证鉴定过程中,针对获取的微量血液 DNA 及血痕 DNA 主要应用 chelex-100 法提取,也可以用酚抽提和二步消化法提取,如混合斑中的精子 DNA。DNA 提取的方法很多,现 在市面上也有一些操作方便的 DNA 提取试剂盒,因物而易,选择简单、适合的方法进行 DNA 的提取。在法医学中,可以通过搜索检测带有 SNP 的 DNA 链,来确定物证如血斑、毛发等的基 因型,进而来排除嫌疑人等。
2.DNA 的定量
用于 SNP 检测的 DNA 用量微小,只需几十纳克,其定量方法同 STR 分析定量方法相似。
3.DNA 的扩增
2XTaqMan Universal PCR Master Mix 试剂盒与 40 X TaqMan SNP Genotyping Assays 试剂 盒联合使用。
(1)DNA、引物及探针用量 DNA 纯度:OD260/OD280=L6〜2.0, 浓度 1〜20ng/μl。 引物和探针浓度:
(3) PCR 循环参数 95oC10 min-^(92oC15s~undefined60°Clmin)X40 个循环。
4.SNP-PCR 检测方法
SNP 的检测方法有很多种。基于 PCR 技术的常用方法主要有限制性酶切片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP)、单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)、异源双链分析 (heteroduplex analysis, HA),这些是早期的常用方法。由于 SNP 的特点,在进行法医鉴定时需要检测的量是STR 的 4 倍以上,也即大概 60个。为此,近年来建立了许多新的 SNP 分型方法和技术,如变性高压液 相色谱分析 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)'幻,引物延伸结合飞 行日寸 I 司质谱分析 (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)'", 动态等位基因特异性杂交 (dynamic allele specific hybridization. DASH) 和基因芯片法、TaqMan 探针技术和焦磷酸测序技术算等。它们的灵敏度及通量 都比之前的方法大大提高,使其在法医检测中得到越来越广泛的应用。这些技术虽然能完成对 SNP 的检测,但应用上也有些不足。有些检测过程繁琐,需要限制性内切酶消化;有些需两步 PCR 扩增反应:有些新技术虽具有通量高、易于自动化等优点,但要求成本昂贵的仪器设备。 基于原理的差异,下面简要介绍几种 SNP 的检测分析技术。
(1)阵列杂交分析 (array hybridization assays)
基于寡核昔酸与不同靶序列变异配对时的杂交稳定性差异原理,主要有两种形式:第一种是 ASO (allele specific oligonucleotide hybridization, 等位基因特异性寡核昔酸杂交) 探针与 DNA 样 品的多重 PCR 产物阵列杂交,适用于扫描多个病例样品中数个致病等位基因,如 MASDA(mul- tiplexed allele specific diagnostic assay, 多重等位基因特异性诊断分析);第二种是 ASO 探针与寡 核昔酸阵列杂交,芦用于多个SNP 的平行分析,成功的关键在于要同时制备数千个用于平行检测 的 PCR 产物,如«DA (variant detector array, 变异检测阵列)、SNP 芯片等。由于 A SO 技术成 熟,已被广泛运用于临床诊断上,如 ASO 可用于以 PAH 基因第 399 密码子由 A-T 的序列多态 性为遗传标记的苯丙酮尿症产前诊断等的临床诊断。
(2)基因芯片技术
基因芯片 (gene chips) 又称 DNA 芯片 (DNA chips ), 或生物芯片 (biological chips), 是用 标记的探针与特定的 DNA 样品杂交,然后通过检测杂交信号的强弱判断样品中靶分子的数量。 由于该技术可以将大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的 DNA 分子进行检测 分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低的 问题。基因芯片检测技术的主要过程:首先,用生物素标记扩增后的靶序列或样品,然后再与芯 片上大量的探针进行杂交;其次,用含链霉素的荧光素作为显色物质,图像的分析则用激光共聚 焦显微镜或其它荧光显微镜对芯片扫描,由计算机搜集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化 后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick 配对双链与具有错配碱基的双链分子相比具有较高 的热力学稳定性,所以前者的荧光强度要比后者强 5%〜35%。从这一点来说,该方法是具有一 定特异性的,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。因此基因芯片已广 泛用于 SNP 检测和多态性分析等方面。如人类线粒体基因组多态性分析,人类基因组单核昔酸 多态性鉴定、作图及分型等。尽管基因芯片技术凭其大信息量,自动化和低成本的特点已得到大 规模的发展,但它也存在许多难以解决的问题,例如检测灵敏度低、多态性差、分析范围较窄等。
(3)同源杂交 (homogenous hybridization)
有两种基于 PCR的同源杂交方法可用于等位基因区分。第一种方法为 TaqMan 系统。它 利用酶的 5'核酸外切酶活性,切割与 PCR 扩增产物结合的 DNA 探针,此探针带有一个 供体-受体荧光染料对,两者能发生荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET ) o 丁幻酶切割使供体染料与猝灭的受体染料分离,结果使供体染料的荧光极大增强。 TaqMan 在 PCR的同时既可得到检测结果,又可将 PCR 污染的风险降至最低。但该方法对反 应试剂及反应条件有严格要求,由于需要重叠光谱,不能同时用两个探针进行分析。另一种 以 PCR 为基础的同源杂交方法是分子信标 (molecular beacons)。供体和受体荧光染料分别位 于有互补序列的探针两侧,当未与靶序列杂交时,探针形成一个「发夹环」结构,使供体-受 体染料对相互靠近而产生猝灭。反之,探针与正确的靶序列杂交时,染料对分离,荧光信号 可增强至 900 倍。探针的发夹结构设计使错误杂交更加不稳定,增加了对 SNP 的选择性。探 针与靶序列的杂交设计在 PCR的退火步骤,而不像 TaqMan 那样设计在延伸步骤,从而增加 了检测的灵敏性。由于无需供体与受体染料的重叠光谱,该法可以同时使用 4个或更多不同 标记的探针。
(4)限制性酶切法
如果 SNP 产生或消除了某个限制性内切酶位点,则可以通过对 PCR 产物酶切,电泳后检测, 估计有半数的SNP 并不导致酶切位点的改变,在 PCR 中引入错配引物可克服这一不足 (如上酶 切法原理所述九该方法适宜于非大量的寻找或检测。
(5)直接测序法(direct sequencing)
直接测序是最容易实施的SNP 检测方法。通过直接测序检测SNP 的基本原理是:通过对 不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率 可达100%。采用直接测序法,还可以得到SNP 的类型及其准确位置等 SNP 分型所需要的重要 参数。随着 DNA 测序自动化和测序成本的降低,直接测序法将越来越多地用于 SNP 的检测与 分型。
(6)焦磷酸荧光法
用大量级联的酶反应检测 DNA 合成时核昔酸的渗入,在 DNA 聚合酶作用下,当 dNTP 加 人到正在生长的新链末端时,就会释放 1 分子 PPi, 在磷酸化酶作用下,转化为化学能,如有荧 光素酶时,可使荧光素氧化,并发出光亮,反应液中还有核昔酸酶,当加入的 dNTP 未结合时便 迅速分解,无光亮。此法,首先是作为一种 DNA 测序法,阅读序列较短,但特异性高,可作为 一种精确的SNP 分型法。
(7)MALDLTOF 质谱分析 (matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry)
1988 年,Karas 和 Hillenkamp 应用 MALDI 对生物大分子进行离子化和质量分析时发现: 适当大小的有机分子晶体 (介质)用接近其吸收光谱的激光瞬时激发,会发生能量转移及解 吸附过程,如将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥,蛋白质或核酸分子 将嵌入到介质晶体中,将该晶体放入质谱仪的真空小室,用瞬时 (纳秒) 强激光激发,晶体 中的蛋白质或核酸分子就会解吸附,转变成气相的离子态,此时可通过质谱分析这些离子。 MALDI-TOF-MS 分析核酸的优点:①速度快,核酸分子的离子化、分离及检测仅在几毫秒 内完成;②分析结果的绝对性,质谱对核酸分子的分离仅与其自身的质量/电荷 (m/z) 有 关,而传统的电泳或杂交方法易受核酸二级结构的影响;③自动化操作。从样品制备到数据 的釆集加工都可自动化完成,适合大规模筛査,有广泛用于检测已知和未知 SNP 及基因分 型和定位研究的前景。
近年来,有很多研究是应用荧光定量 PCR 中的SNP 分析平台,其主要是基于等位基因特异 性杂交原理,通过检测 PCR 过程中产生的荧光信号来区分等位基因,每检测一个SNP位点需要 一对 TaqMan 探针(或分子信标)和一对位于检测位点的上下游引物。下面介绍一种新的基于荧 光定量 PCR 检测SNP位点的方法,它不需要设计特异性的 TaqMan 探针,只是通过溶解曲线的 分析来区分等位基因,从而大大降低了检测成本。
该方法使用了两种不同的等位基因特异性正向引物,每个正向引物 3'端的最后一个碱基对应 于SNP位点的二等位基因,反向引物都一样,并使用荧光染料(SYBRggnD 来检测PCR 产 物。纯合子基因组 DNA 只能被与其完全匹配的正向引物扩增,而杂合子基因组DNA 能同时和 两种正向引物结合扩增出两种 PCR 产物。
为了区分这两种扩增产物,在其中一个等位基因特异性引物的 5』加一个 20bp 左右含(G+C)的重复序列。由于 DNA 的溶解温度主要与其片段长度和(G+C)含量有关,经过修饰后的引物 的长度和(G+C)含量明显高于另一个等位基因特异引物,因此,使用这两种引物后的 PCR 扩 增产物有着不同的以值。在 PCR 扩增结束后,运行一个溶解曲线程序,即让产物慢慢从 60 笆 升温到 90°C, 从溶解曲线图上就可以分析出哪种等位基因参与了 PCR扩增,由此也得到了相应 的基因组的基因型。
在PCR反应体系中,加入过量 SYBR green I 荧光染料,SYBR 荧光染料掺入 DNA 双链后 荧光信号显著增强;当 DNA 变性时 SYBR green I 染料释放出来,荧光急剧减少;随后在聚合 延伸过程中引物退火并形成 PCR 产物,SYBR green 染料与双链产物结合,经检测获得荧光的净 增量。荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行熔解,称为熔解曲线分析。在熔解曲线分析过 程中,随着温度从低于产物熔解点缓慢升到高于产物熔解点,定量 PCR 仪连续监测每个样 品的荧光值。基于产物长度和(G+C)含量的不同,扩增产物会在不同的温度点解链。 随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对熔解曲线进行微分可以计 算出熔解峰。熔解峰可以反映反应中扩增到的产物,因此用熔解曲线数据就可以进行定 量监督了。
以上分类并无严格的区分界线,PCR 与荧光检测常同时使用,它们已成为基因分型最基本 的方法。现在至少存在 20 多种 SNP 分型方法,有些新方法具有操作简单。易于自动化的优点, 但其高额的成本以及昂贵的检测系统是许多实验室所无法承担的,限制了广泛使用,但由于人类 基因组测序完成,需进行大量基因组 SNP 研究,必须发展高通量 SNP分型技术。如一年分析 1000个样品,10 万个SNP, 每天要有大于 30万基因型通量。
5. 数据库
人们对 SNP 的研究方法进行了许多探索和改进。SNP分析技术按其研究对象主要分为 两大类。①对未知 SNP 进行分析,即找寻未知的SNP 或确定某一未知 SNP与某遗传病的关 系。检测未知 SNP 有许多种方法可以使用,如温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶 电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)、变性的高效液相色谱检测(DHPLC)、限制性 片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性 DNA(RAPD)等,但这些方法只能发现含有 SNP的 DNA 链,不能确知突变的位置和碱基类别,要想做到这一点,必须对那些含有 SNP的 DNA 链进行测序。在法医学中,可以通过搜索检测带有 SNP的DNA 链,来确定 物证的基因型,进而来排除嫌疑人等。②对已知 SNP 进行分析,即对不同群体SNP 遗传 多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。筛查已知 SNP的方法有 等位基因特异寡核昔酸片段分析(ASO)、突变错配扩增检验(MAMA)、基因芯片技术(gene chips)等。由于人类基因工程的带动,许多物种都已开始了基因组的项目,并建立 了大量数据库(见表 13-8), 比较这些来自不同实验室不同个体的序列,就可以检测 到 SNPO

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序