单核甘酸多态性 PCR

根据实验方法不同，对应的原理也有所不同：

1 . 引物延伸法
(1) 质谱检测法 ［图 13-6(a)］ 这种方法是利用一个引物在 SNP±游一个碱基位点退火延 伸时结合 ddNTP。延伸产物被质谱检测，延伸产物的质量不同，引物识别掺入的核昔酸并确定 SNP 基因型。
(2) 毛细管电泳法荧光检测 ［图 13-6(b)］ 这种方法是利用引物在延伸 SNP 上游的碱基位 点时，延伸产物 ddNTP 带有不同的荧光标签。毛细管电泳后通过荧光检测产物，根据染料的颜 色指示掺入碱基的种类，从而达到 SNP 基因分型。
(3) 等位基因特异性引物检测 PCR 产物 ［图 13-6(c)］ 这种方法是利用两个等位基因特异性 引物在延伸时，它们的 3'末端在 SNP 位点，和一个普通的反向引物共同进行 PCR 反应。这个反应 只在正向引物的 3'末端能完全延伸到 SNP 位点，反应才会发生，根据 PCR 的产物能推测基因型。

2. 特异探针杂交法
（a）探针阵列的靶位点杂交°这种方法是利用带标签的等位基因特异性探针结合在杂交的 SNP 的 靶位点固体表面。清洗表面去除错误配对的靶目标，而完全配对的靶目标和探针就能通过荧光被 检测，以达到基因分型。（b）TaqMan 微阵列。这个阵列是利用两个等位基因特异性探针携带不 同的报告基因和猝灭剂染料在探针的一端，在错配对的 SNP 位点。正确配对的探针在 PCR 扩增 SNP 包含区时离开，释放它的报告基因，荧光检测确定 SNP。基因型如图 13-7 所示。

3. 核昔酸连接法 (图 13-8)
(1) 用 CFET 标签检测 这种方法是使用两个带有不同 CFET 标签的等位基因特异性探针和 一个带有生物素标签的普通探针，与邻近的序列杂交。如果在 SNP 位点正确配对，等位基因特 异性探针连接普通探针，反之，不连接。通过普通探针的生物素标签和来自 CFET 标签的荧光信 号来确认连接法，进而确定 SNP 基因型。
(2) 挂锁探针的连接法 这种方法是使用两个等位基因特异性探针与目标 DNA 杂交， SNP 位点处它的末端与邻近的序列杂交成一环形。如果正确配对，则探针的一个末端即特异 性等位基因与另一端连接，形成环形。可以用一种特殊引物通过滚环扩增检测，经过凝胶电 泳分析产物。

4. 酶切法 (图 13-9)
(a) 限制性核酸内切酶酶切。这种方法是用一种限制性酶只酶切一种等位基因。限制消化的产物在 凝胶上检测，根据不同大小的片段数量推测 SNP 基因型。(b) 入侵试验。这个试验是使用两个等 位基因特异性探针携带不同的报告基因和猝灭剂染料在它的任一末端，还有一种普通入侵探针。等 位基因特异性探针和入侵探针杂交，在目标 DNA 上在 SNP 位点处形成一个三维结构，可以被分裂 酶识别。在等位基因特异性探针和 SNP 位点完全结合时内切酶酶切三维结构并释放报告基因染料, 通过检测荧光也可以确定 SNP 基因型。

单核甘酸多态性PCR 的常用应用领域如下：
SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别 等方面的研究。
1. 医学方面的应用
据美国1994年的报告，因药物副作用而入院的患者达200 万人，因药物副作用而死亡的人 数达 10 万人，占死亡原因的第4位，比因交通事故死亡的人数还多得多。因此，通过对不同个 体的药物代谢相关酶、转运因子、药物作用靶点的基因多态性研究，在分子诊断学水平上建立基 因分型方法，在治疗患者的各种疾病前，进行个体 SNP 分型，来更精确地选择适当的药物、减 少不良反应的发生，是预防毒副作用并提高药物疗效的关键。而人类基因组之间的单个核昔酸的 不同，就决定了疾病易感性、保护人体免受疾病侵害、在疾病发作时耐受疾病的能力不同，因 此，这些信息在医学研究中有巨大的潜力a
（1）疾病基因、易感基因的定位 通过对比健康和患病人群SNP 发生频率的差异，确定 SNP 与疾病之间的相关性，或者比较高危人群与低发人群SNP 的差异，就可以鉴别出哪些 SNP 和哪些疾病有关。应用高密度的 SNP 图谱，用相关分析的方法来定位一系列多基因疾病，诸如 癌症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病的主基因及寻找疾病易感性的遗传标记［叫。 目前30 个以上的疾病基因是直接依据已获得的公开的基因组序列而定位克隆的，如神经递质受和生长因子的发现、阿尔奇海默症和帕金森症的基因定位等戮。目前在单个 SNP 与疾病相关 性的检测方面报道的较多，大规模或全基因组范围内检测 SNP与疾病相关性的报道较少。高建 平等应用自动实时荧光技术，分析了 78 例肝癌患者和 112 例健康志愿者N-乙酰基转移酶（NAT2）4 个位点的基因多态性，探讨NAT2 基因多态性与肝癌易感性的关系，结果表明携带 NAT2慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群逐。鼻咽癌是我国广东地区高发性的肿 瘤，我国国家基因组南方中心已对鼻咽癌等多种疾病展开深入研究，建立了家系收集网络，取得 了一定进展。Tx是来自鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因克隆，冷曙光在癌基因组剖析计划数据 库中进行生物信息学分析，确定其存在SNP 位点，并预测出8个候选SNP 位点，采用变性高压 液相色谱分析了 80 名健康个体与82名鼻咽癌患者基因组中这些确定位点的分布，结果显示鼻咽 癌患者中杂合型（GC/CG）频率（52.44%）显著高于健康个体（33.75%）, 而纯合型（GG）频 率（31.70%）则低于健康个体（56.25%）, 由此推论Tx杂合型可能是鼻咽癌的危险因子W气 目前已有实验将SNP应用于肿瘤预后及易感性的判断，例如肺癌致癌物的易感性存在个体差异， 对此研究较多的有代谢酶基因多态性，如I相代谢酶人细胞色素 P450-CYP450和髓过氧化酶（MPO）等，研究证实MP。基因启动子（一463 G>A）多态性导致该基因较低的表达，可以降 低肺癌患病的危险性㈣。另外日本学者还发现了 HER-2 基因编码区的一个 SNP与胃癌的发展 及恶性程度有关 ［初。阮黎等运用 PCR-RFLP 方法，检测血液标本中钙粘连素（CDHJ）基因启 动子上游一 160 处 C/A 的 SNP, 探讨膀胱移行细胞癌（TCCB）E-钙粘连素（CDH1）基因启动 子一 160 处 C/A 单核昔酸多态性与 TCCB 复发及低分化的关系，结果显示：CDH1 基因启动子 -160 处 SNP 对膀胱移行细胞癌的复发可能具有重要作用，检测该 SNP 也可作为一种预测患者 术后复发的指标〔建。苏湛等釆用引物引人限制性内切酶分析（PIRA-PER）、四引物扩增阻滞突 变系统以及单链构象多态性技术，对 100名正常人和 88例系统性红斑狼疮患者八 2 基因的 3 个 SNP 位点（dbSNP： rsl800477, r&1801018. rsl564483）, 施々 基因的 3 个 SNP 位点（db- SNP：饵 6060900, 饵 6089046, 饵 5841091）及 Mr 基因的 I 个微卫星位点进行了分析，结果表明 belr2基因 YS1800477 和 rsl564483 二位点多态性可能与系统性红斑狼疮相关项］0 周晶等应用自 动测序仪对 106 名中国汉族非亲缘关系人的生长激素受体（GHR）基因部分外显子进行序列测 定，观察这些SNP 在汉族人群中的分布，结果显示出生长激素受体基因 SNP 呈不均匀分布且具 有种族差异性〔切。王海俊等通过选择 184 名重度肥胖和184 名低体重青少年，对促生长激素分 泌素受体（GHSR）基因两个单核昔酸多态性进行快速高通量基因型分析，来了解 GHSR 基因 多态性与青少年肥胖的关系，结果未发现该人群中 GHSJ? 基因 2 个多态性与青少年肥胖有关 联逐七 李义等通过公共 SNP 数据库和对样本库全基因测序寻找 SNP 位点的途径，在定位区域内 选择了 33 个候选基因中的 124 个 SNP 位点，用测序法对 236 例北方汉族散发 II 型糖尿病患者及 152例正常对照个体进行 SNP 基因分型及病例-对照关联分析，并对具显著性差异的 SNP 位点进 行单倍型分析，发现 SAG R4NK4 和 CASP9 基因为中国北方汉族人群 II 型糖尿病候选易感基 因，由此推论这 3 个基因可能在 n 型糖尿病易感性上有协同作用逐。随着高自动化、高通量、 高准确性和低成本 SNP 检测技术的发展，Zhou 等京］ 利用两条常染色体上的 20 个 SNP, 使用荧 光定量 PCR 的方法，检测早期结肠癌患者的等位位点来判断病人预后。Mohammad 等 ［瓶利用高 密度 SNP 芯片（包含近 1500 个 SNP）分析，在全基因组范围内检测了膀胱癌患者的 SNP发生 情况，这种全基因组范围内的 SNP 分析具有潜在的预后和诊断价值。
通过基因易感性的分析，能够确认特定疾病的好发性人群，从而对该人群进行生活或饮食方 式的干预，促进其健康。
（2）药靶的研究 人类遗传性的疾病达到了 8000 多种，而目前市场上存在的所有的药靶不 到 500 个 K 如，一旦了解了全部人类基因和蛋白质，将大大扩展所适合的药靶范围，即使是一小 部分基因或基因表达产物被证明可以作为药靶，预期药靶数目也会超过几千个。
2. 法医学
法医学中生物检材的个人认定正是利用人类群体具有高度的 DNA 多态性作为工具进行的，
从最早的 RFLP 技术到现在大多数法医 DNA 实验室广泛使用的 STR 基因分型技术，都存在不足 之处。特别是当遇有高度腐败、降解、陈旧检材和小片段 DNA 不能进行 STR 扩增，这时就可进 行 SNPs 检测，为个体识别提供有效的方法。
SNP 用于法医学主要有三方面优势：①低突变率，稳定遗传，有利于个体识别和亲权鉴定； ②双等位基因变化，可用高通量的方法自动分型，易于建立「罪犯 DNA 数据库」；③Y 染色体 SNP 较敏感，可用于种族起源预测和男性鉴定。有作者采用寡核昔酸连接分析 (PCR-OLA) 测 定含有 20 个常见 SNP 的 PCR 扩增片段作基因分型，这种分型可以采用比色分光光度方法，并 自动化完成，因而能在较大群体中进行。
单核甘酸多态性 (SNP) 对于法医学提出的特殊问题不只是由于结果与目前构成国家数据库 的 STR 图谱不相容。而且，在法医学中个性化是必要的，因此每一种样品都需要对数百种 SNP 进行分析，因为每一样品就本身而言可能仅仅是双态的。使人感兴趣的是因为许多双态位点在人 群中很普遍，所以一个随机个体与现场犯罪材料有相同的 SNP图谱的统计学概率实际上很高。
现在一致公认的原则是：从伦理学上考虑，只能使用非编码区 DNA 进行法医案件的调查， 以防止无意中了解一个人对某种疾病的易感性。目前正在建立用于临床诊断的 SNP 数据库，必 定会吸引法医科学家使用这些现成的数据库，这在将来可能引起伦理的反对。这种进步必将导致 实验室的完全自动化，可以预见不久的将来，从接收到提取、定量、扩增到结果的分析、解释将 实现全面自动化；进一步研究把实验室过程微型化为可移动的系统，这种系统需要把富含 PCR 产物的区域与样品输入的区域分离。任何背离已经建立的原则都将导致对结果的可靠性的质疑。 犯罪审判系统顺应出现的新技术将是一项艰巨的任务，维护证据的保护措施是很重要的。