采用流式和影像细胞术多参数分析细胞凋亡

细胞凋亡是调节细胞的动态平衡，流式细胞仪的多参数特性可对同一标本中数个细胞凋亡指标同时进行测定，为分析不同细胞复杂的凋亡过程提供了一个有力的工具。目前，分析细胞凋亡方法采用。

采用流式和影像细胞术多参数分析细胞凋亡的基本原理是利用 DNA 结合染料作为膜通透性指示剂（如 propidium iodide,PI）结合其他指标来评价与细胞凋亡相关的不同细胞反应，包括如线粒体膜电位、能结合到「翻转的」PS 上的 annexin V 等，对整个细胞死亡过程提供了更广泛而多维的图片数据。

器材：流式细胞仪。

试剂：PhiPhiLux-G1D2 caspase 3 荧光底物。

采用流式细胞术评估淋巴细胞介导的细胞毒作用的实验步骤如下：

（一）细胞准备

A. 收集悬浮的细胞系或培养的原代细胞，转移到 12 x75 mm 的细胞培养管。

B. 细胞经 400 g、5 min 离心后，弃上清。除去上清对下面步骤很关键，留上清液的量应尽可能少。

C. 每样本标记（0.5-2）×106 个细胞; 增加细胞的量将减少 caspase 和 annexin V 标记的效率。

（二）荧光 caspase 底物的标记

A. 细胞首先标记 PhiPhiLux caspase 底物。

B. 轻打试管, 在残留的上清液重悬细胞试管中上清液体积约为 50ul。

C. 加 50ul PhiPhiLux 试剂到每个试管中并轻轻振荡。（见注释 4.4）。

D.37℃ 孵育，45 min。

（三）Annexin V 的标记

A. 细胞用荧光染料耦联的 annexin V 进行标记。

B. 孵育 45 min 后，上述管子移去上清并加适当荧光染料耦联的 annexin V（PE 或 APC）。

C. 室温孵育 15 min。

D. 加 3 mL 洗液到每个试管,400 g 离心 5 min, 轻轻倒出上清液。

（四）DNA 结合染料标记

A. 溶解 PI（2pLg/mL）或 7-AAD（5jjig/mL）到完全培养基中。

B. 在上述试管去除上清后加 0.5 mL PI 或 7-AAD 溶液。样本应室温中放置,60 min 内完成分析。

（五）流式细胞仪检测分析

细胞应尽快分析以减少实验后的细胞凋亡。仪器应设置好并立即完成样本收集。荧光检测器的分配和分析问题：

A.PhiPhiLux-G1D2: 荧光黄样的 caspase 底物，在大多数流式细胞仪上通过荧光黄或 FITC 通道分析（定义为 FL1）, 常常配以 530/30nm 或类似窄带通滤光片。PhiPhiLux-G1D2 荧光素的光谱特征类似荧光黄。与 PE 或 PI 同时使用时，需要调节颜色补偿（很少与 7-AAD 使用）。

B.PE 耦联 annexin V：大多数 PE 耦联试剂，通过 PE 通道检测（通常定义为 FI2），常常配以 575/26-nm 或类似带通滤光片。当与 PhiPhiLux-G1D2 和 7-AAD 使用时，需要调节颜色补偿。

C. APC 偶联 annexin V ：红色激光器激发，在许多流式细胞仪上通过 APC 通道检测（往往定义为 FI4），用 660/20nm 或类似带通滤光片，APC 在多色分析中最大的好处是极少需要调节补偿，与 PhiPhiLux-G1D2、PI、7-AAD 没有明显的光谱重叠。

D.PI：此 DNA 结合染料即使在很低浓度时也很亮，具有很宽的发射范围，与 PhiPhiLux-G1D2 使用时需要颜色补偿。可以在 PE 或远红外检测通道中检测（用 PE575/26nm 滤光片或较长的红色光谱），而后者能减少荧光漏进荧光素检测器。

E.7-AAD：此 DNA 结合染料比 PI 暗，发射远红外光, 可在多数流式细胞仪的远红外通道中检测（定义为 FL3）, 用 675/20 带通或 650nm 双色或类似滤光片。与 PhiPhiLux-G1D2 和 PE 使用时需要颜色补偿。在一些多色测定系统中，尚不清楚什么原因 7-AAD 能轻微猝灭 PE, 故在仪器安装时要考虑。

（六）设门

A. 散射门：多数细胞系和一些原代细胞在细胞凋亡晚期，前向或侧向散射分析时会有很 大的变化（细胞大小或光学密度是粗略的指标）。因此，设门圈定散射活细胞群，来观察 caspase 的活性 annexin V 的结合和 DNA 染料的摄取来单独作为细胞早期死亡的测量指标。但是，散射凋亡细胞群中可能包含一些活细胞，这些细胞在细胞死亡的其他标志如 caspase 活化之前，发生了细胞体积的瞬态变化。因此, 为了精确地分析细胞的死亡，应选择全部散射细胞群（剔除明显的碎片）。随后的对活细胞群（实际上可能包含早期凋亡的细胞）设门应在 annexin V 或 DNA 染料结合的基础上进行。

B. Annexin V 结合和 DNA 结合染料的排除: 这些标志常常发生在 caspase 活化之后，被认为是凋亡后期标记。因此,annexin V 和 DNA 结合染料的阳性和阴性亚群能用来设门以区别早期和后期凋亡细胞。对随后的这些细胞群 caspase 活化分析能进一步区分细胞凋亡的早期阶段。