磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定是了解磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）梭化酶的功能，熟悉酶偶联法测定 PEP 稜化酶活性的方法。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定的基本原理是PEP梭化酶是 C₄ 植物和 CAM 植物固定 CO₂ 的关键酶。在 Mg²⁺ 存在下，PEP 梭化酶可催化 PEP 与 HCO₃^- 形成草酰乙酸（OAA），后者在苹果酸脱氢酶（MDH）催化下，可被 NADH 还原为苹果酸（Mal）。其反应如下：

通过在 340 nm 处测定反应体系吸光度的变化，计算出 NADH 的消耗速率，进一步推算出 PEP 梭化酶的活性。

材料：玉米、高粱等 C₄ 植物的叶片。

试剂：

提取缓冲液：0.1 mol・L^-1 Tris-H₂SO₄ 缓冲液（pH7.4），内含 7 mmol・L^-1 疏基乙醇、1 mmol・L^-1 EDTA、5% 甘油；

平衡缓冲液：10 mol・L^-1 Tris-H₂SO₄ 缓冲液（pH8. 2），内含 0.2 mmol・L^-1 EDTA、 0.2 mol・L^-1 DTT（二硫苏糖醇）、5% 甘油；

反应缓冲液：0.1 mol・L^-1 Tris-H₂SO₄ 缓冲液（pH9.2），内含 0.1 mol・L^-1 MgCl₂；

反应试剂：100 mmol・L^-1 NaHCO₃、40 mmol・L^-1 PEP、1 mg・L^-1 NADH（pH8.9）、苹果酸脱氢酶（MDH）。

器材：

① 紫外分光光度计

② 冷冻离心机

③ 组织捣碎机

④ Sephadex G-25 柱（2 cm × 45 cm）

⑤ DEAE（二乙氨乙基）-纤维素（DE-52，1 cm × 30 cm）柱

⑥ 紫外监测仪

⑦ 部分收集器

⑦ 蠕动泵

磷酸烯醇式丙酮酸裝化酶活性的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 粗酶液提取

将叶片洗净并吸去水分，去掉中脉。称取 20 g，放入冰箱中过夜，次日剪碎 后放入组织捣碎机中，加入提取缓冲液（已预冷）80 mL，20 000 r/min 匀浆 2 min（运行 30 s、间歇 10 s，反复匀浆），用 4 层纱布过滤，取滤液于高速冷冻离心机上 15 000 g 离心 10 min，上清液即为 PEP 梭化酶的粗酶提取液。

2. 酶的纯化

(1) 硫酸铉分步沉淀：将上述粗酶液装入烧杯，于搅拌器上搅拌，缓慢加入固体硫酸铉粉末达到 35% 饱和度，在冰箱中静置 1 h， 于 15 000 g 下离心 10 min，取上清液再缓慢加入固体硫酸铉粉末达到 55% 饱和度，冰箱静置 1 h，再于 15 000 g 下离心 10 mm，弃上清液，沉淀用平衡缓冲液 8 mL 复溶。

(2)Sephadex G-25 柱层析：先用平衡缓冲液平衡 Sephadex G-25 柱（2 cm × 45 cm）。将上述复溶溶液上柱，压样 2 次，用平衡缓冲液洗脱，洗脱速度为 50 mL・h^-1，通过检测仪，收集有酶活性的部分，于 15 000 g 下离心 10 min，上清液即为 PEP 梭化酶的部分纯化酶液。

(3)DEAE-纤维素柱层析：把转型的 DEAE-52 装入 1 cm × 30 cm 的层析柱，用平衡缓冲液平衡 2 h，将上述已部分纯化的酶液上 DEAE-52 柱，压样 2 次，用平衡缓冲液洗脱，通过紫外检测仪后收集。再用平衡缓冲液配制 0~0.6 mol・L^-1 NaCl 溶液进行连续性梯度洗脱（速度为 30 mL・h^-1），收集有酶活性的部分即为纯化的 PEP 侵化酶，用于酶活的测定。

3. 酶活测定

取试管 1 支，依次加入 1.0 mL 反应缓冲液，0.1 mL 40 mmol・L^-1 PEP，0.1 mL 1 mg・mL^-1 NADH（pH8.9），0.1 mL 苹果酸脱氢酶和 0.1 mL PEP 梭化酶（已纯化的提取液），1.5 mL 蒸馏水，在所测温度（如 30 ℃）下恒温水浴保温 10 min，在 340 nm 下测定吸光度值 A₃₄₀（A₀）；然后加入 0.1 mL 100 mmol・L^-1 NaHCO₃ 启动反应，立即计时，每隔 30 s 测定一次吸光度值（A₁），记录其变化。

4. 实验结果

式中：V—测定混合液总体积，3 mL；

L 一比色杯光程，cm;

0.1 一反应混合液中酶液用量，mL；

m 一酶液稀释倍数；

△A = A₀ - A₁；

a一 NADH 于 340 nm 处的摩尔消光系数（6.22 × 10³ mol^-1・cm^-1）。

1. 酶提取过程应在 0~4 ℃ 下进行。

2. 测定时的酶液用量需事先试验，苹果酸脱氢酶的用量视 PEP 梭化酶活性大小而定，也可事先通过实验确定最佳用量。