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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定

相关实验:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定

最新修订时间:

简介

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定是了解磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)梭化酶的功能,熟悉酶偶联法测定 PEP 稜化酶活性的方法。

原理

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的测定的基本原理是PEP梭化酶是 C4 植物和 CAM 植物固定 CO2 的关键酶。在 Mg2+ 存在下,PEP 梭化酶可催化 PEP 与 HCO3- 形成草酰乙酸(OAA),后者在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下,可被 NADH 还原为苹果酸(Mal)。其反应如下:

通过在 340 nm 处测定反应体系吸光度的变化,计算出 NADH 的消耗速率,进一步推算出 PEP 梭化酶的活性。

材料与仪器

材料:玉米、高粱等 C4 植物的叶片。

试剂:

提取缓冲液:0.1 mol・L-1 Tris-H2SO4 缓冲液(pH7.4),内含 7 mmol・L-1 疏基乙醇、1 mmol・L-1 EDTA、5% 甘油;

平衡缓冲液:10 mol・L-1 Tris-H2SO4 缓冲液(pH8. 2),内含 0.2 mmol・L-1 EDTA、 0.2 mol・L-1 DTT(二硫苏糖醇)、5% 甘油;

反应缓冲液:0.1 mol・L-1 Tris-H2SO4 缓冲液(pH9.2),内含 0.1 mol・L-1 MgCl2

反应试剂:100 mmol・L-1 NaHCO3、40 mmol・L-1 PEP、1 mg・L-1 NADH(pH8.9)、苹果酸脱氢酶(MDH)。

器材:

① 紫外分光光度计

② 冷冻离心机

③ 组织捣碎机

④ Sephadex G-25 柱(2 cm × 45 cm)

⑤ DEAE(二乙氨乙基)-纤维素(DE-52,1 cm × 30 cm)柱

⑥ 紫外监测仪

⑦ 部分收集器

⑦ 蠕动泵

步骤

磷酸烯醇式丙酮酸裝化酶活性的测定的基本过程可分为如下几步:

1. 粗酶液提取

将叶片洗净并吸去水分,去掉中脉。称取 20 g,放入冰箱中过夜,次日剪碎 后放入组织捣碎机中,加入提取缓冲液(已预冷)80 mL,20 000 r/min 匀浆 2 min(运行 30 s、间歇 10 s,反复匀浆),用 4 层纱布过滤,取滤液于高速冷冻离心机上 15 000 g 离心 10 min,上清液即为 PEP 梭化酶的粗酶提取液。

2. 酶的纯化

(1) 硫酸铉分步沉淀:将上述粗酶液装入烧杯,于搅拌器上搅拌,缓慢加入固体硫酸铉粉末达到 35% 饱和度,在冰箱中静置 1 h, 于 15 000 g 下离心 10 min,取上清液再缓慢加入固体硫酸铉粉末达到 55% 饱和度,冰箱静置 1 h,再于 15 000 g 下离心 10 mm,弃上清液,沉淀用平衡缓冲液 8 mL 复溶。

(2)Sephadex G-25 柱层析:先用平衡缓冲液平衡 Sephadex G-25 柱(2 cm × 45 cm)。将上述复溶溶液上柱,压样 2 次,用平衡缓冲液洗脱,洗脱速度为 50 mL・h-1,通过检测仪,收集有酶活性的部分,于 15 000 g 下离心 10 min,上清液即为 PEP 梭化酶的部分纯化酶液。

(3)DEAE-纤维素柱层析:把转型的 DEAE-52 装入 1 cm × 30 cm 的层析柱,用平衡缓冲液平衡 2 h,将上述已部分纯化的酶液上 DEAE-52 柱,压样 2 次,用平衡缓冲液洗脱,通过紫外检测仪后收集。再用平衡缓冲液配制 0~0.6 mol・L-1 NaCl 溶液进行连续性梯度洗脱(速度为 30 mL・h-1),收集有酶活性的部分即为纯化的 PEP 侵化酶,用于酶活的测定。

3. 酶活测定

取试管 1 支,依次加入 1.0 mL 反应缓冲液,0.1 mL 40 mmol・L-1 PEP,0.1 mL 1 mg・mL-1 NADH(pH8.9),0.1 mL 苹果酸脱氢酶和 0.1 mL PEP 梭化酶(已纯化的提取液),1.5 mL 蒸馏水,在所测温度(如 30 ℃)下恒温水浴保温 10 min,在 340 nm 下测定吸光度值 A340(A0);然后加入 0.1 mL 100 mmol・L-1 NaHCO3 启动反应,立即计时,每隔 30 s 测定一次吸光度值(A1),记录其变化。

4. 实验结果

式中:V—测定混合液总体积,3 mL;

L 一比色杯光程,cm;

0.1 一反应混合液中酶液用量,mL;

m 一酶液稀释倍数;

△A = A0 - A1

a一 NADH 于 340 nm 处的摩尔消光系数(6.22 × 103 mol-1・cm-1)。

注意事项

1. 酶提取过程应在 0~4 ℃ 下进行。

2. 测定时的酶液用量需事先试验,苹果酸脱氢酶的用量视 PEP 梭化酶活性大小而定,也可事先通过实验确定最佳用量。

来源:丁香实验

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