连续流热梯度 PCR

连续流热梯度 PCR 是一种新的 DNA 扩增技术，它的特点是在 PCR 过程中周期性温度的改变无需设定在特定的循环时间内。

连续流热梯度 PCR 的基本原理是连续流热梯度 PCR 仪具有一个流体槽, 该流体槽有数个弯曲循环部分，弯曲的数量与 PCR 扩增所需的循环次数相对应，以满足 PCR 过程中所需的热循环条件。流体槽的各个部位被环绕它的具有恒定温度梯度的装置加热到特定的不同温度，同时流体槽 之间需要保持一定的距离和绝缘性，以确保不同部位保温度的独立性，当流动的样品经过时诱导扩增的热循环就开始了。这种加热方式省去了热负荷的环节，仅有扩增的过程，通过这种方式可以实现更少的能耗和更快的循环速度。

Niel Crews 等⑴利用连续流热梯度 PCR 技术扩增病毒 DNA 和人类基因组 DNA, 在一个 30 个循环的芯片上，以 1.5S/min 的流速扩增出了 UObp 和 181bp 的病毒抗药 DNA 片段。在一个 40 个循环的芯片上，以 2. 0 Ml/min 的流速扩增出了一个 108bp 的人类基因组 Y 染色体片段。
Yuyuan Li 等⑵在不同的流速 (2.0-15. Omm/s) 和不同 DNA 模板量 (0. 001-7. 5ng/Ml) 条件下摸索了连续流热梯度 PCR 的扩增效果，并与普通 PCR 扩增结果进行对比。发现当反应体 系的流速大于 10 mm/s 时扩增产物不易被检测到。

①器材：

PCR 扩增仪、精密注射泵。

试剂：

①模板 dnao

②引物。

③Taq 聚合酶。

④10Xtaq 缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl, pH8. 3, 500 mmol/L KC1；0.1% 明胶；15 mmol/L MgCl2）o

⑤dNTPs（200umol/L）。

⑥髙压灭菌去离子水。

⑦牛血清白蛋白（BSA）。

⑧次氯酸钠。

连续流热梯度 PCR 的基本过程可分为如下几步：

在 25/xl 的反应体系中包括：
①10XPCR 缓冲液；
②MgCl2（1. 5 mmol/L）；
③dNTPs（各 0. 2 mmol/L）；
④引物（各 0. 5umol/L）；
⑤模板 DNA（5ng/ul）
⑥Taq DNA 聚合酶（0. 1U/ul）；
⑦BSA 0. 25 g/L；
⑧ddHzO 加至总体积 25 ul o
使用精密注射泵沿连续流 PCR 仪的毛细管人口端将上述反应体系匀速注入，当反应体系流 经过全部毛细管后，用 0.2 mL 的聚丙烯管在出口端收集液体，于 4°C 保存，用于后续分析。

此外，在一次 PCR 过程结束后需要加一个清洁步骤，来清除毛细管内残留的 PCR 产物，以 便循环使用 PCR 仪。清洁剂的组成是，首先为 100ul 含 15% 次氯酸钠的清洁剂，接着为两段 100ul 的纯水，纯水之间有一段 50ul 的矿物油。让清洁剂以大约 30ul/min 的速度流经芯片上的毛细管。

由于扩增产物的量与反应体系中模板 DNA 的量及反应混合液流经毛细管的速度有关，因此在实际操作中应通过对注射器压力的调整控制反应体系在毛细管中的流速，以达到最佳扩增效果。