铜绿假单胞菌感染小鼠肺炎模型

该模型真实准确地反映了铜绿假单胞菌肺部感染的体内特性，为铜绿假单胞菌的慢性肺部感染相关研究提供基础。

用琼脂糖包埋细菌做成琼脂珠后以富含致病菌的琼脂珠灌注小鼠，使铜绿假单胞菌对呼吸道上皮细胞的反应减弱，不能被有效消除，宿主产生弱免疫应答， 引起慢性感染发展。

该模型真实准确地反映了铜绿假单胞菌肺部感染的体内特性，为铜绿假单胞菌的慢性肺部感染相关研究提供基础。

器材：

① 雄性昆明小鼠

试剂：

① 2% 琼脂糖溶液

② 10% 乙醚

铜绿假单胞菌感染小鼠肺炎模型的基本过程可分为如下几步：

A. 实验动物。选用 6～8 周龄雄性昆明小鼠，体重 26～32 g，经支气管接种铜绿假单胞菌琼脂糖珠悬液 50 ul 构建。

B. 菌株配制。选取经对数生长期的单个铜绿假单胞菌菌落接种至 2 ml TSB 中培养过夜 （37 ℃，18 小时）。加入 1 ml 50 ℃ 2% 琼脂糖溶液，并快速移动到 5 ml 50 ℃ 液状石蜡中。室温下搅拌 6 分钟，容器底放置于碎冰上冷却 10 分钟。

低温离心 （4 ℃ 9000 xg） 20 分钟。吸去上清，加入 PBS 混匀，洗琼脂糖珠 2 次。所得琼脂糖珠直径在光学显微镜下观察大约 120～200 um。用麦氏比浊管调整菌液浓度至 0.5 个麦氏单位。

C. 具体方法。10% 乙醚纱布薰小鼠 1 分钟麻醉后，将小鼠固定在专用手术台上， 颈部前侧做术前准备， 剪刀剪 -0.8 cm 的横切口，止血钳剥离挑出气管，7 号静脉注射针头插人气管底部，针管与 1 ml 注射器相连，注入 50 ul 有铜绿假单胞菌琼脂珠悬液。立即竖起小鼠，保持 2 分钟，使菌液流下进入肺内，小鼠有类似呛咳反应。切开伤口不做处理，自然愈合。

D. 检测内容。各时段，经 10% 乙醚麻醉后，经心脏取血，获取血清标本 -80 ℃ 储存用于细胞因子等检测；收集肺泡灌洗液进行细菌培养及细胞因子检测；肺组织病理学检测。

小鼠在接种铜绿假单胞菌菌珠后 1 天即出现炎性细胞反应，至 3 天则形成局限性病灶，至 5～7 天炎症反应明显减轻，但仍可在病理切片中观察到中性粒细胞浸润。

支气管肺泡灌洗液检测显示接种菌株 3 天后，TNF-α 和 IL-6 的水平达到峰值，并于 7 天左右恢复至接近正常水平，与肺组织纤维化相关的血清中金属基质蛋白酶 2 在感染后 3 天达峰值。