显微受精技术

显微受精技术又称显微操作辅助受精技术，是20世纪80年代发展起来的一种体外受精技术。该技术通过显微操作仪修饰卵子透明带，或将精子或精细胞直接注入卵子内部，辅助其完成与卵子的受精过程。

目前有透明带修饰和精子注入两种方式，前者包括透明带钻孔法（zona drilling，ZD）和透明带切口法（partial zona dissection，PZD），后者包括透明带下注射法（subzonal insemination，SUZI）和胞质内注射法（ICSI）。

器材：

⑦细胞培养箱

试剂：

显微受精技术的基本过程可分为如下几步：

1．固定针和注射针的准备

（1）注射针制备：将经过消毒的外径为1 mm的毛细玻璃管固定在拉针仪上，调节好拉针仪的参数，拉出所需的理想针形。通常从针的一端到开始变细处的长度以8-10 mm为宜。

将拉制好的针管固定在煅烧仪上，在玻璃针内径5～6 μm处拉断玻璃针管。然后将针管以40°～50°的角度置于磨针仪上，在磨石上先加一些水，调节升降杆使针的尖端与磨石的平面刚好接触，把针磨成斜面。

将针置于煅烧仪上拔尖，拔尖时先将铂金球、玻璃针位置调整好，然后开始加热铂金球。这时将玻璃针慢慢靠近，当针尖稍微有些熔化时，迅速拉开，拉出的针尖应该是短而锐利的。将制备好的针置于用70％ 乙醇清洗过的塑料盒中存放，用前经紫外线灯照射20分钟。

（2）固定针制备：将经过消毒的外径为1 mm的毛细玻璃管固定在拉针仪上，拉出理想的针形。将拉制好的玻璃管固定在煅针仪上，于外径方80～120 μm处拉断玻璃针管。

然后将断好的玻璃针管靠近铂金球，调整温度使电热丝发红，直至针口缩到30～40 μm时停止，针口须平滑，当内径变为20-40 μm时，停止加热。

2．卵子和精子的准备

（1）卵母细胞的收集和处理：卵母细胞来源主要有两种：一是经超数排卵获得的体内成熟的卵母细胞；二是从屠宰场收集卵巢，抽取未成熟的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）经体外成熟（IVM）培养获得。

显微注射前，卵母细胞要用0.1％ 的透明质酸酶处理，去除其周围的颗粒细胞，然后置于覆盖有液体石蜡的卵母细胞操作液中备用。对于脂肪含量较高的卵母细胞如牛和猪，可通过离心使卵母细胞中的脂肪滴被甩向一侧，使卵母细胞变得透明，以利于显微操作。

（2）精子的准备：新鲜或冻存的精子均可用于显微注射，使用前需要根据试验设计对精子进行若干处理，如：精子获能；去除精子尾部及顶体制备精核。

精子孵育液中加入PVP，一方面使游动的精子丧失运动能力，便于捕捉精子，另一方面经这样处理的精子不容易粘在注射针管壁上，利于精子的释放；精子孵育液中加入三硫苏糖醇（DTT），该物质对某些动物精核的解聚有一定作用，可以提高雄原核的形成率。

3.显微受精操作步骤

（1）显微操作时，如果是用有活力的精子做注射，则要破坏其尾部中段的质膜，使其失去活动能力，这个过程即称为精子制动。因为在正常受精过程中，精卵质膜融合，精子在卵母细胞质中释放一种能够激活卵母细胞的因子-精子因子（SF），引起卵母细胞胞质内的Ca浓度波动，从而激活卵母细胞。

制动的目的就是使精子注入卵胞质后能够较快地释放SF。精子制动后，将其从尾部吸入注射针。注射时，用固定针固定卵母细胞，使极体位于12点位置，注射针在3点位置穿过透明带，向9点方向深入卵胞质，先回吸少量卵胞质，以确定质膜已被刺破，再将精子注入卵胞质内。

（2）使用Piezo操作时，首先在注射针的尾部装入3-4 mm水银，再将注射针装入注射装置中。将水银向针尖推进，并在水银和注射针内的液体石蜡之间保留一段空气柱。

把注射针降到第1个PVP液滴中，来回吐吸操作液数次以润滑注射针管壁，并利用脉冲检查水银跳动情况，若看到水银跳动，说明Piezo电脉冲传递顺利。针装好后制作PVP液-液体石蜡-PVP液缓冲柱，并保持水银在注射视野范围内。

注射前，用卵吸管把8～10枚卵母细胞移入操作液滴中，然后注射针在精子液滴中吸取1个精子放入第3个PVP液滴中，用针尖在精子尾部迅速划过进行制动，随后从尾部吸取精子。

注射时调整极体在12点钟位置，从3点钟位置进针，同时用Piezo脉冲击穿透明带，继续进针后将精子推至针尖处，此时质膜因弹性随注射针尖凹入卵内，至针尖接近对侧质膜时，用Piezo弱脉冲击穿质膜，吐出精子，并回吸注入卵内的多余液体，轻轻退针，完成一次注射。

4.注射卵的激活及体外培养

1．注射卵的激活 在传统的ICSI中，显微注射过程对卵母细胞的刺激就可以充分激活人、兔、鼠等的卵母细胞；但对牛和猪等，注射针和精子的机械刺激不足以激活卵母细胞，需要额外的化学或其他刺激才能激活注射卵，而卵母细胞激活是精子解聚和雄原核形成的前提。