ES细胞显微注射法制作嵌合体大鼠

嵌合体（chimera）在遗传学上用于指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体；在免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排斥反应，相互间处在嵌合状态。

人工地将两个或两个以上具有不同遗传性状的早期胚胎或把具有特种遗传性状的细胞和早期胚胎聚合或显微注射所产生的个体称之为嵌合体动物（chimeras）。嵌合体的广泛应用得益于胚胎干细胞技术的发展。

制作嵌合体动物主要有两种方法：聚合法和显微注射法。聚合法是指将去透明带的两个或多个早期胚胎聚集或者将胚胎与多能性干细胞聚集，形成一个嵌合胚胎，移植后获得嵌合体动物的方法。

器材：

①显微操作平台：

倒置显微镜（Leica，DMIRB，German）

液压显微操作臂（NARISHIGW，07003，Japan）

油压和气压注射控制器（Eppendorf，Cell-Tram，German

Pizeo（PRIME TECH，PMM，Japan）以及水平防震台

②注射器

③无菌手术器械

④巴氏吸管

⑤37 ℃，5％ CO₂ 培养箱

⑥体视镜

⑦15 ml 离心管

⑧持卵针

⑨口吸管

⑩离心机

试剂：

①材料：大鼠

③PBS

④胰蛋白酶

胚胎移植的基本过程可分为如下几步：

1．注射用囊胚的准备

(1) 挑选8周龄的健康性成熟雌性大鼠，挑发情，并与同品系雄性大鼠进行交配。

(2) 次日见栓记为 EO.5dpc。见栓后 E3.5dpc 时，断颈法处死雌性大鼠，用无菌手术器械剪取子宫。

(3) 利用胚胎操作液M2冲取双侧子宫获取囊胚。

(4) 将收集的大鼠囊胚移入大鼠胚胎培养液 mR1ECM-2C 并放入37 ℃，5％ CO₂培养箱中备用。

2．制备周期同步的假孕雌性大鼠。

3．注射ES细胞准备

(1)在注射前2小时给ES细胞换上新鲜的培养基；移去培养基，用PBS洗两遍；

(2)加入适量的0.05％ 胰蛋白酶，在37 ℃，5％ CO₂培养箱中孵育10～15分钟；

(3)加入适量的ES细胞培养基，终止消化。

(4)轻轻用巴氏吸管吹打三四次，将细胞吹散成单细胞悬液；

(5)将细胞悬液移到一新的预先铺盖0.1％ 明胶的组织培养皿中，放回37 ℃，5％ CO₂培养箱中孵育20～30分钟；

(6)轻轻拿出培养皿，收集含有ES细胞的全部培养基，留下贴壁的MEF细胞；

(7)将最后收集的培养基移入15 ml离心管中，1000 r／min离心5分钟；弃上清用500 μl培养基重悬，并轻吹打成单细胞悬液；

(8)冰上放置15分钟，吸走2／3上清，然后补回500 μl培养基；将细胞放冰上待用。

4．显微注射操作

(1) 用M2操作液加入到自制操作皿“Chamber”（或用大皿皿盖代替）中，以液体石蜡覆盖

(2) 用持卵针（外径约80 μm）固定好大鼠囊胚，吸取靠近ICM部分，使ICM部分大约固定在9点位置上：

(3) 用外径约15 μm的平口注射针吸取10-15个供体细胞，从约3点位置进针，抵住受体囊胚透明带以及滋养层细胞与细胞间的连接处，用Piezo给定脉冲，使注射针进入囊胚腔，将供体细胞吐在内细胞团（ICM）上。

(4) 操作完成后的胚胎移入大鼠平胚胎培养液mR1ECM-2C，并放置于培养箱中继续培养。

5．嵌合胚胎的移植

(1) 显微操作完成的胚胎，培养箱中继续培养1-2小时，待囊胚腔重新膨胀起来后进行胚胎移植。

(2) 使用浓度为0.05 g／ml的水合氯醛溶液对假孕大鼠进行麻醉，腹腔注射水合氯醛（每只1.5～2.0 ml）。

(3) 10分钟后大鼠处于完全麻醉状态。用75％ 乙醇消毒小鼠背部，剃毛后在背部体侧剪口，找到输卵管／子宫，用钟表镊轻轻夹住卵巢的脂肪垫，并将输卵管／子宫拉出。

(4) 在体视镜下把胚胎装入到口吸管中，口吸管按照三段法装管：先吸入一小段KSOM培养液，然后再吸入一个小气泡，再去吸取胚胎，吸完胚胎后再吸入一小个气泡和一小段KSOM培养液。将待移植的大鼠囊胚注入3.5天假孕鼠子宫角中。

(5) 移植后将子宫／输卵管小心放回大鼠腹腔中，并进行手术缝合。