简介
巨噬细胞可以发生不同性质的功能活化（极化），成为具有不同表面分子和功能特征的 M1 和 M2 亚群。M1 型巨噬细胞是 Th1 型免疫反应过程中产生的效应巨噬细胞，主要由微生物产物（如 LPS）或干扰素γ（IFN-Y）诱导产生。
其特点是分泌一化氮（NO）、反应性氧中介物等杀伤分子和多种炎症因子（IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α和 Type IIFN 等）以及趋化因子（CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL16、CCL2、CCL3、CCL4 及 CCL5 等）。
此外，巨噬细胞在 IFN-Y 刺激下，可增加诱导型一氧化氮合酶（inductible nitricoxide synthase，iNOS）的分泌，还能表达大量的 CD16／32、MHC II、CD40、CD80、CD86 及 B7 等分子，进而参与提呈抗原和激发 Thl 型免疫应答，杀伤感染病原体和肿瘤细胞。
因此，通常认为 M1 型巨噬细胞是机体免疫防御和抗肿瘤的强有力的效应细胞。M2 型巨噬细胞在不同的诱导信号下将分化为不同的亚型，包括：
① M2a 型，刺激信号是 IL-4 和 IL-13，诱导 Th2 型免疫反应，在过敏性反应和寄生虫感染免疫中起主要作用。
② M2b 型，刺激信号是免疫复合物和 Toll 样配体（如 LPS）或 IL-1R 配体，介导 Th2 型活化和免疫调控。
③ M2c 型，刺激信号是 IL-10 和糖皮质激素，介导免疫调控，参与基质沉积和组织修复。M2 型巨噬细胞抗原提呈能力差，并通过下调 M1 型巨噬细胞的功能等方式控制人体的炎症反应。M2 型巨噬细胞具有修复损伤、促进血管形成以及组织重构的作用。
原理
分别采用相应的诱导剂对巨噬细胞极化进行诱导；通过对 M1 和 M2 型巨噬细胞表型相关指标的比较分析，可评价和鉴定巨噬细胞类型的表型，如 M1 型标志（CD16／32、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、NO 及 iNOS 等）、M2 型的标志（CD206／mrc-1、IL-10、Arg-1 及 Yml 等）。
材料与仪器
动物：
6～8 周龄 C57/BL6J 小鼠
试剂：
1) LPS、IFN-Y、IL-4；
2) 细胞因子及趋化因子检测试剂盒（如 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12 及 IL-10 等；CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL17、CCL18 及 CCL22 等）；
3）real-time PCR 试剂，iNOS、Arg-1、YmL、Fizz1 及各种细胞因子或趋化因子引物；
4）NO 检测用 Griess reagent 试剂盒；
5）流式细胞术及 Western blot 检测试剂，anti-CD16/32、anti-iNOS、anti-CD206 等的标记抗体、PVDF 膜；
6）巨噬细胞吞噬功能检测：红色荧光吞噬微球。
仪器：
1）酶标仪；
2）real-time PCR 仪；
3）流式细胞仪；
4）垂直电泳仪、转移电泳槽
步骤
一、巨噬细胞极化的诱导
1）分离小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度至 1 × 106/mL，加入 12 孔或 24 孔板。
2）M1 型 MΦ 的极化诱导：LPS（1 μg/mL，终浓度）、IFN-y（20ng/mL，终浓度）加入培养液中，培养 24～96 小时。
3）M2a 型 MΦ 的极化诱导：IL-4（20 ng/mL，终浓度）加入培养液中，培养 24～96 小时。
4）M2b 型 MΦ 的极化诱导：免疫复合物-抗 LDL（低密度脂蛋白 100 μg/mL，终浓度）与 LDL（5~10 μg/mL，终浓度）或人 IgG（10 μg/mL，终浓度）及兔抗人 IgG（10 μg/mL）培养 24~96 小时。
5）M2c 型 MΦ 的极化诱导：IL-10（20 ng/mL，终浓度）加入培养液中，培养 24～96 小时。
6）对极化巨噬细胞进行形态学观察：巨噬细胞极化后形态发生变化，向 M1 型方向极化的巨噬细胞呈长梭形，伪足较为细长；M2 型极化巨噬细胞伪足较短，细胞整体形态较为收拢。
7）对巨噬细胞极化类型进行鉴定分析。
二、巨噬细胞极化类型的鉴定
不同指标可采用不同的技术手段进行检测：收集上述细胞及细胞培养上清，通过流式细胞仪检测细胞膜分子 CD16／32 和 CD206 表达，通过实时定量 PCR 和 ELISA 试剂盒分析特征因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12 及 IL-10 的表达及分泌，通过实时定量 PCR 或 Western blot 分析 iNOS、Arg-1 或 Yml 的表达，通过 Griess reagent 分析细胞培养上清 NO 生成。
以下列举几种巨噬细胞极化类型的鉴定方式，可根据情况采用多种手段结合，每种极化类型选取至少 4 种指标作为分型特征。
1）巨噬细胞分泌 NO 能力检测：收集上述处理巨噬细胞上清，使用 Griess Reagent 检测 NO，具体步骤参见 Griess Reagent 说明书。
2）流式细胞术检测巨噬细胞表面标志：用细胞刮收集上述诱导极化后的巨噬细胞，使用 anti-CD16/32、anti-iNOS、anti-CD206 等荧光标记抗体进行流式细胞仪检测鉴定。
3）real-time PCR 检测巨噬细胞表面标志及细胞因子基因水平的表达情况：提取巨噬细胞总 RNA 经反转录得到 cDNA，根据 Genbank 收录的小鼠 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、iNOS、Arg-1、YmL 的基因序列设计引物，使用实时定量 PCR 仪对巨噬细胞的表面标志及细胞因子进行转录水平定量分析。
4）Western blot 分析巨噬细胞表面标志及细胞因子蛋白水平的表达情况：提取巨噬细胞总蛋白，通过 Western blot 分析检测 iNOS、Arg-1、YmL 的表达。
5）ELISA 试剂盒检测巨噬细胞分泌的细胞因子及趋化因子：收集上述处理巨噬细胞上清，使用 ELISA 试剂盒检测细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12 及 IL-10 的分泌；使用 ELISA 试剂盒检测趋化因子 CCL2、CCL3 以及 CCL22 等的分泌。具体步骤参见 ELISA 试剂盒说明。
6）荧光微球法检测巨噬细胞体外吞噬活性：将处理过的红色荧光吞噬颗粒与小鼠腹腔巨噬细胞 37 ℃ 共孵育 1 小时，荧光显微镜检测吞噬的荧光微球情况，也可采用流式细胞术检测吞噬百分率。
7）Arg-1 活性测定：以 100 μl 0.1％ TritonX-100 裂解巨噬细胞，加入 100 μl 50 mmol／L Tris-HCl 和 10 mmol／L MnCl2，56 ℃ 温育 10 分钟，加入 100 μl 0.5 mol／L Arginine，37 ℃ 温育 30 分钟，加入 800 μl H2SO4 终止。随后加入 50 μl 9％ α-异亚硝基苯丙酮（α-isonitrosopropiophenone），95 ℃ 温育 30 分钟；540 nm 波长检测吸光度（A 值），以尿素（Urea）建立标准曲线，间接判断 Arg-1 活性。
注意事项
（1）培养过程中需肉眼及显微镜观察细胞有无污染。
（2）如用培养上清来检测相关指标，上清应经离心处理后再进行检测，以免掺杂破碎细胞影响实验结果。
来源：丁香实验
