原位缺口平移技术

原位切口平移技术又称为原位缺口翻译（in situ nick translation）。它最早用于研究DNA体外复制，其后又扩展至研究染色体、培养细胞与组织切片的DNA转录效力。

它一方面具有实感性，便于观察记录；另一方面也可作半定量（计数银颗粒）或定量（收集细胞作液闪测定）测定，其优点是显而易见的。

本技术是在分子水平上反映遗传物质的改变，因此其敏感性要比诸如染色体畸变、断裂、姊妹染色单体交换频率改变、微核形成以及碱洗脱法与荧光分析法敏感得多。

在实用上又有外加DNase I与不加DNase I两种。

前者主要用以区别有无转录活性或潜在转录活性的染色质或基因；而后者主要用于检测致癌物、致突变物或辐射等因子对细胞DNA的断裂损伤作用。

原位切口平移技术的基本原理是大肠杆菌DNA聚合酶I（Escherichia coli DNA polymerase I）可从一条DNA链缺口（nick）的5＇端切除核苷酸，同时从缺口的3＇端连接核苷酸，并依次顺序进行，其结果切口沿DNA平移。

因此，新合成的数量可反映出DNA链的断裂（受损）的程度。原位缺口平移技术，乃是将缺口移位技术与同位素放射自显术结合起来，从而可在细胞核或染色体上反映出DNA受损的程度。

器材：

①显微镜

②PCR仪

③紫外检测仪

④高速离机、恒温水浴箱、高速真空干燥机

试剂：

①材料：培养的细胞

②Carnoy 固定液

③500 mmol／L Tris-HCl（pH 7.4），50 mmol／L MgCl2， 100 mmol／La-巯基乙醇

④10 mmol／L dATP、dGTP、dCTP、dTTP，3H-dTTP

⑤BSA

⑥大肠杆菌 聚合酶I

原位切口平移技术的基本过程可分为如下几步：

（1）细胞培养及处理 实验可用正常细胞或恶性细胞，视实验目的而定，将细胞接种于预先放置有盖片（2.2 cmx2.2 cm）的小号塑料培养皿内（直径3.4 cm）。

每皿加2ml含适量血清与抗生素的培养基（如DMEM）。每皿的细胞总数为3x10⁵个。将培养皿放入37 ℃ CO₂孵箱内。

24 h后细胞已很好地贴附在盖片上，吸去培养基，以不含血清的DMEM洗2次，加入不含血清的DMEM或含有一定浓度测试药物（如本实验以MNNG，醋酸棉酚为例）的DMEM。

（2）细胞的固定 在经上述测试药物作用一定时间后，将盖片取出，以PBS（pH 7.4）洗涮，清除细胞碎片等。

然后用3：1的冰醋酸-甲醇Carnoy 液固定15 min，待晾干后用树胶将上述附着有细胞的盖片固定于载片之一端。

须记住的是细胞面朝上！1 d后树胶干涸，进行下一步的原位缺口平移反应。

（3）原位缺口平移反应 于上述盖片上，滴加30 μl缺口平移反应液，使其淹没细胞，并以另一张清洁盖片覆盖其上，须注意不要有气泡，以确保反应液浸渍所有的细胞。

为此，要先准备混合液A，然后再配制反应液。本实验以10张标本为例，以示需配多少溶液。

①混合液A 500 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),188 μl；50 mmol/L MgCl₂,188 μl; 100 mmol／Lα-巯基乙醇，188 μl；10 mmol／L dATP，5.64 μl；10 mmol／L dGTP，5.64 μl； 10 mmol/L dCTP，5.64 μl;10 mmol/L dTTP，5.64 μl。

②反应液 混合液A，96.3 μl；3H-dTTP，16 μl；大肠杆菌聚合酶I（200 U／ml），30 μl；BSA（2 mg／ml），15 μl；双蒸水，145.4 μl。

（4）终止反应 15 min后移去上覆的盖片，用50 mmol／L Tris-HCI（pH 7.4）洗涮数次，以洗去反应液。

接着再以95％ 乙醇浸渍30 min，晾干后（约30 min），进行同位素自显术程序。

（5）放射自显术 将上述经原位缺口移位反应的盖片在暗室内浸渍Kodak放射自显术乳胶（也可用核IN乳胶），但乳胶应事先在室温中预温，通常可稀释1倍。

晾干后（约30 min）置于装有干燥剂的密闭容器内，4 ℃曝光3 d。

（6）显影与定影 放射自显术的显影剂与定影剂。这里我们推荐用D19液，显影5 min，定影10 min，然后自来水漂洗15 min。

（7）标本的染色 标本可用吉姆萨染色。笔者推荐地衣红（orcein）染色，其流程如下：2％ 地衣红染色10 min；

水洗数秒钟；冰醋酸-水混合液（1：1）洗数秒钟；95％ 乙醇处理1 min；正丁醇、正丁醇-二甲苯混合液（1：1）、二甲苯I、二甲苯II各处理数秒钟；中性树胶封片。

（8）观察与记录在油镜下记数每个细胞核中的银颗粒数、同时减去相等面积的本底颗粒数，即为每个核中的真正银颗粒数。

一般要随机取视野，共观察100个细胞以上，同时做显微摄影记录。如做定量分析，则可收集细胞，进行液闪测定，各组互相比较。

（1）目前已有原位缺口平移反应液药盒出售，可不必自行配制。

（2）若没有3H-dTTP，也可用3H-TdR代替。