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性染色质制备实验

相关实验:性染色质制备实验

最新修订时间:

简介

性染色质制备实验可采取口腔黏膜细胞、尿液中的脱落细胞、羊水细胞、绒毛细胞等作为检查的材料,可同时检测 X 染色质和 Y 染色质。

原理

性染色质制备实验的基本原理是正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体,即X染色质,这是女性细胞中一条 X 染色体随机 Lyon 化失活形成的。


这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体,使两性在 X 连锁基因产物的数量上保持在相同水平,称为 X 染色体的剂量补偿。


X 染色质是正常女性细胞中特有的,细胞中 X 染色质的数目比 X 染色体的数目少一条。Y 染色质是正常男性的 Y 染色体长臂的异染色质区,在间期被荧光染料染色后,形成的强荧光小体。

材料与仪器

器材:


① 载玻片


② 染色缸


③ 压舌板(或灭菌牙签若干)


④ 显微镜


⑤ 荧光显微镜


⑥ 人口腔黏膜细胞


⑦ 尿液


⑧ 羊水。


试剂:


① 0.85% 生理盐水


② 固定液(3 份甲醇:1 份冰醋酸,现用现配)


③ 1 mol/L HCl


④ 硫堇染液


⑤ 1% 结晶紫染液


⑥ 石炭酸-复红染液


⑦ 无水乙醇


⑧ 95%/70%/50% 梯度乙醇


⑨ 二甲苯


⑩ Mcllvaine 缓冲液


⑪ 氮芥喹吖因(QM)

步骤

性染色质制备实验的基本过程可分为如下几步:


1.标本制备


(1)口腔黏膜细胞


A 让受检者用 0.85% 生理盐水漱洗口腔数次,尽量除去口腔内细菌和其他杂物。


B 操作者一手拉住受检者的下唇,一手用木质(或金属)压舌板或牙签钝头端刮取其两侧颊部或下唇内侧的黏膜(弃去第一次刮到的细胞)。


C 同一部位连续刮取数次,将刮取物涮入装有 5 mL 0.85% 生理盐水的离心管内。


D 1500 r/min 离心 10 min,弃掉上清液,留下细胞团。


E 加入新配制的固定液(3 份甲醇:1 份冰醋酸)10 mL,轻轻混匀制成悬液。固定 30 min。


F 1500 r/min 离心 10 min,弃掉上清液,留下细胞团。


G 根据细胞团多少加入数滴新配制的固定液,充分混匀制成悬液。


H 取一滴悬液滴至预冷的干净载玻片上,晾干。


(2)尿液中的脱落细胞


A 令受检者将尿液排至一干净的烧杯或瓶内。


B 搅动尿液后吸取尿液 10 mL 至离心管内,1500~2000 r/min 离心 10 min,弃掉上清液,留下细胞团。


C 加入新配制的固定液(3 份甲醇:1 份冰醋酸)10 mL,固定 30 min。


D 1500 r/min 离心 10 min,弃掉上清液,留下细胞团。


E 根据细胞多少加入数滴新配制的固定液,充分混匀制成悬液。


F 取一滴悬液滴至预冷的干净载玻片上,晾干。


(3)羊水细胞,羊水中的细胞都是来自胎儿的细胞,因此可抽取羊水细胞做 X 染色质检查以做出胎儿性别的产前诊断。


A 按妇科常规经壁穿刺妊娠 16 周左右孕妇的羊水约 10 mL(抽取时,先抽出 2~3 mL 的羊水弃去,以免有母体细胞污染)。


B 1500 r/min 离心 10 min,弃掉上清液。


C 加入新配制的固定液(3 份甲醇:1 份冰醋酸)10 mL 至细胞团上,混匀成细胞悬液,室温固定 30 min。


D 1500 r/min 离心 10 min,弃掉上清液。


E 根据细胞多少加入数滴新配制的固定液,充分混匀制成悬液。


F 取一滴悬液滴至预冷的干净载玻片上,晾干。


2.X染色质染色


(1)硫堇染色法


A 将玻片标本置入 1 mol/L HCl 中,37 ℃ 条件下水解 20 min。


B 用蒸馏水充分冲洗,空气干燥。


C 将固定后的玻片标本浸入硫堇染液中染色约 15 min。


D 蒸馏水冲洗,空气干燥。


E 先在低倍镜下寻找细胞集中而又均匀分散的细胞群,再转油镜观察。


(2)结晶紫染色法


A 固定后的玻片标本依次经过 70%、50% 乙醇处理(中间更换两次蒸馏水),每次 5 min。


B 浸入 1% 结晶紫溶液中染色 5~8 min(大量制片时可用 0.5% 结晶紫染液,染色 10~15 min)。


C 将玻片标本置 95% 乙醇中分化(快速地在 95% 乙醇中醮 5~8 次)。


D 将玻片标本置无水乙醇中分化,间歇地用显微镜检查,直至标本中核结构的微细部分都很清楚为止(一般约 1 min)。


E 浸入二甲苯中。更换2次二甲苯,每次 3 min,以使标本透明。


F 树胶封片。


G 先在低倍镜下寻找细胞集中而又均匀分散的细胞群,再转油镜观察。


(3)石炭酸-复红染色法


A 将石炭酸-复红工作液滴至玻片标本上,染色 5 min。


B 经 95%、100% 乙醇脱水,各 30 s。


C 先在低倍镜下寻找细胞集中而又均匀分散的细胞群,再转油镜观察。


3.Y染色质染色


A 用 pH6.0 Mcllvaine 缓冲液配制 0.005% 氮芥喹吖因溶液(现用现配),配制后需装入深色瓶中(可在 4 ℃ 冰箱保存两周)。


B 将玻片标本浸入 pH6.0 Mcllvaine 缓冲液几秒钟。


C 将玻片标本浸入 0.005% 氮芥喹吖因溶液 10 min 以上。


D 再将玻片标本置于 pH6.0 Mcllvaine 缓冲液(或蒸馏水)中分色 10 min。


F 在荧光显微镜下观察,若荧光弱,等待 10 min 后再观察;若荧光太强,揭掉盖玻片,置于 pH6.0 Mcllvaine 缓冲液浸泡一下,再封片观察。

注意事项

1 刮取口腔黏膜细胞时,压舌板或牙签应按同一方向刮取,不要来回刮,以免损伤口腔黏膜。


2 尿液在室温下可防止 6 h 而不改变细胞形态。但最好在取材后立即制作标本,避免放置时间较长而污染细菌或使细胞变质。


3 观察 Y 染色质时,应注意女性细胞也可能出现发亮的荧光小体,但这些细胞的荧光点大小、亮度均不一致,应加以区分。

来源:丁香实验

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