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显微注射技术

相关实验:显微注射技术

别名:nuclear transfer, 核移植

最新修订时间:

简介

核移植(nuclear transfer)技术,又称显微注射技术,是哺乳动物克隆(cloning in mammalian)技术的核心组成部分,从核移植成功之日就受到科学界的高度重视。世界上第一只成年体细胞克隆动物「Dolly」的诞生,在动物遗传学和动物胚胎学上取得历史性突破,引起科学家对动物克隆技术的极大关注。

原理

核移植技术原理是通过显微操作技术将一个细胞的细胞核,移植到去核的卵母细胞或去核卵子内,组建成新的重组体,使供体细胞核在卵细胞胞质中发生发育程序重编(reprogram-ming),然后移植于受体动物,在其体内发育成为一个新个体。血清对细胞的生长有促进作用,极低浓度血清的培养基仅能维持细胞处于某种状态,而不发生增殖。在核移植研究中,这种处理能协调供体和受体细胞的周期达到同步,有利于重组胚胎中供体核的重塑,从而促进核移植胚胎的发育。

材料与仪器

器材:


① 体视显微镜


② CO2 培养箱


③ 电融合仪


④ 超净工作台


⑤ 显微操作仪

试剂:


① 材料:同步化处理的大鼠成纤维细胞、供卵母鼠、凹载玻片、眼科器械、持卵器、移卵管、去核针、注核针

② 矿物油


③ 小牛血清


④ 胎牛血清

⑤ 0.25% 胰蛋白酶


⑥ PBS


⑦ M16 培养液


⑧ 细胞松弛素 B(CCB)

⑨ 0.1% 透明质酸酶


⑩ 无水乙醇

步骤

核移植的基本过程可分为如下几步:

1.收集卵母细胞


(1)将供卵雌鼠以颈椎脱臼法处死,75% 乙醇浸泡 5 min,腹卧位固定于鼠板上,由腰后背部横向剪开皮肤,用大镊子向头部撕开。

(2)分别剪开背部两侧腹腔,将肠移至一侧,由脂肪垫捏住卵巢。在子宫角处切断,将卵巢和输卵管移入平皿,以 PBS 洗去血液和残渣。

(3)体视显微镜下,在含有 0.1% 透明质酸酶的培养液中,用锋利的镊子或针破开膨大的输卵管壶腹部。卵丘-卵母细胞复合体团将释放入培养液,在酶的作用下缓慢分离。


(4)当卵分离后,立即将卵母细胞转移至 M16 培养液中,以 M16 培养液洗涤 3 遍,显微镜下挑选有明显第一极体的卵母细胞进行去核。

2.卵母细胞的盲吸法去核


(1)将有明显第一极体的卵母细胞放入含 10 μg/ml 细胞松弛素 B 的 M16 培养液中孵育 15 min,移至显微操作仪上。

(2)用持卵针在第一极体的对侧固定卵母细胞,将去核针于固定管的斜口调整靠近第一极体,刺破透明带,进入卵周隙,吸出第一极体及附近细胞质,吸出细胞质总量的 1/4~1/3.

(3)将去核后的卵母细胞在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 30 min,凡具有完整细胞结构、细胞质未离散的卵母细胞可判断为去核成功。

3.核移植


(1)将同步化处理后的大鼠成纤维细胞用 0.25% 胰蛋白酶进行常规消化,M16 培养液悬浮。

(2)以移卵管转移至凹载玻片,卵母细胞移入同一液体,覆盖矿物油,防止蒸发。

(3)显微镜操作台上,持卵管固定去核的对面,用注核针在液体中反复吸取供体细胞,使供体细胞膜破溃,然后将供体细胞核由去核口注入受体细胞质。

4.重组胚胎的激活


1800 V/cm 电压,30 ms 脉冲激活重组胚。


5.重组胚的培养


将激活后的核移植重组胚移入 M16 培养液,37 ℃,5% CO2 培养箱中培养。

6. 实验结果及分析


(1)培养后 48 h,观察重组胚的卵裂情况。

(2)培养后 72 h,观察重组胚的继续发育,部分可发育至桑椹胚。

注意事项

(1)提前准备同步化处理的大鼠成纤维细胞。

(2)提前准备供卵母鼠。

(3)仔细操作,提高去核效率。


来源:丁香实验

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