显微注射技术

核移植(nuclear transfer)技术，又称显微注射技术，是哺乳动物克隆(cloning in mammalian)技术的核心组成部分，从核移植成功之日就受到科学界的高度重视。世界上第一只成年体细胞克隆动物「Dolly」的诞生，在动物遗传学和动物胚胎学上取得历史性突破，引起科学家对动物克隆技术的极大关注。

核移植技术原理是通过显微操作技术将一个细胞的细胞核,移植到去核的卵母细胞或去核卵子内，组建成新的重组体，使供体细胞核在卵细胞胞质中发生发育程序重编(reprogram-ming)，然后移植于受体动物，在其体内发育成为一个新个体。血清对细胞的生长有促进作用，极低浓度血清的培养基仅能维持细胞处于某种状态，而不发生增殖。在核移植研究中，这种处理能协调供体和受体细胞的周期达到同步，有利于重组胚胎中供体核的重塑，从而促进核移植胚胎的发育。

器材:

① 体视显微镜

② CO₂ 培养箱

③ 电融合仪

④ 超净工作台

⑤ 显微操作仪

试剂:

① 材料:同步化处理的大鼠成纤维细胞、供卵母鼠、凹载玻片、眼科器械、持卵器、移卵管、去核针、注核针

② 矿物油

③ 小牛血清

④ 胎牛血清

⑤ 0.25% 胰蛋白酶

⑥ PBS

⑦ M16 培养液

⑧ 细胞松弛素 B(CCB)

⑨ 0.1% 透明质酸酶

核移植的基本过程可分为如下几步:

(1)将供卵雌鼠以颈椎脱臼法处死，75% 乙醇浸泡 5 min，腹卧位固定于鼠板上，由腰后背部横向剪开皮肤，用大镊子向头部撕开。

(2)分别剪开背部两侧腹腔，将肠移至一侧，由脂肪垫捏住卵巢。在子宫角处切断,将卵巢和输卵管移入平皿，以 PBS 洗去血液和残渣。

(4)当卵分离后，立即将卵母细胞转移至 M16 培养液中，以 M16 培养液洗涤 3 遍，显微镜下挑选有明显第一极体的卵母细胞进行去核。

(1)将有明显第一极体的卵母细胞放入含 10 μg/ml 细胞松弛素 B 的 M16 培养液中孵育 15 min，移至显微操作仪上。

(2)用持卵针在第一极体的对侧固定卵母细胞，将去核针于固定管的斜口调整靠近第一极体，刺破透明带，进入卵周隙，吸出第一极体及附近细胞质，吸出细胞质总量的 1/4~1/3.

(3)将去核后的卵母细胞在 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养 30 min，凡具有完整细胞结构、细胞质未离散的卵母细胞可判断为去核成功。

(1)将同步化处理后的大鼠成纤维细胞用 0.25% 胰蛋白酶进行常规消化，M16 培养液悬浮。

(2)以移卵管转移至凹载玻片，卵母细胞移入同一液体，覆盖矿物油,防止蒸发。

(3)显微镜操作台上，持卵管固定去核的对面，用注核针在液体中反复吸取供体细胞，使供体细胞膜破溃，然后将供体细胞核由去核口注入受体细胞质。

将激活后的核移植重组胚移入 M16 培养液，37 ℃，5% CO₂ 培养箱中培养。

(1)培养后 48 h，观察重组胚的卵裂情况。

(2)培养后 72 h,观察重组胚的继续发育，部分可发育至桑椹胚。

(1)提前准备同步化处理的大鼠成纤维细胞。

(2)提前准备供卵母鼠。

(3)仔细操作,提高去核效率。