简介
利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物，使得新合成的 DNA 序列发生定点突变，经克隆测序获得突变体。
原理
利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变的基本原理是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物，使得新合成的 DNA 序列发生定点突变，经克隆测序获得突变体。
材料与仪器
试剂：
M13 噬菌体、培养基、DNA 聚合酶、
仪器：
PCR 仪、培养箱、测序平台
步骤
利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变的基本过程包括以下几步：
(1)目的基因的克隆：将目的基因（通常<500bp)克隆到适当的 M13 噬菌体载体，如 M13mpl8/M13mpl9 等（该系列噬菌体克隆载体可用蓝白筛选）。挑单个噬菌斑扩增培养，提取双链 DNA 进行酶切鉴定。将插入了目的基因片段的噬菌斑用于定点突变。
(2)定点突变引物的设计：按照拟突变的位点设计并合成定点突变引物。该引物在用于单链噬菌体 DNA 合成之前，需用 T4 多核苷酸激酶使其 5'-端磷酸化。
(3)噬菌体单链 DNA 的纯化：M13 噬菌体在复制过程中产生单链环状 DNA,并被包装为噬菌体颗粒，从细菌中分泌出来，所以单链 DNA 存在于培养上清中。此步骤的目的是获得含有目的基因的 M13 噬菌体单链环状 DNA。
(4)突变引物引导噬菌体 DNA 的合成：首先使突变引物与噬菌体 DNA 退火。使用步骤 3 获得的单链 M13 噬菌体 DNA，将磷酸化的突变引物和 M13 通用测序引物与之混合。先加热至突变引物 Tm 值 20℃ 以上，再缓慢降至室温。模板 DNA 用 0.5 pmol/L(约lµg)，磷酸化的突变引物和通用引物（与突变引物在同一方向）均用 10 pmol/L，反应体积为 10µ1。在完成退火的模板和引物 DNA 中，加入 10µ1DNA 聚合酶 Klenow 反应混合体系充分混匀后于 16℃ 孵育 12 小时。转化大肠埃希菌 TGl，按噬菌体操作方法铺板。对噬菌体克隆进行鉴定及测序，最终获得突变克隆。
来源：丁香实验
