丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
收藏
wx-share
分享

体外基因定点突变

实验分类:

DNA 实验

最新修订时间:

简介

体外基因突变技术分随机突变(random mutagenesis)和定点突变(site-directed mutagenesis)两类。定点突变常用技术包括:利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变利用 PCR 进行体外基因定点突变


原理

定点突变常用技术有:利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变利用 PCR 进行体外基因定点突变  
利用 M13噬菌体进行体外基因定点突变的基本原理是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物,使得新合成的 DNA 序列发生定点突变,经克隆测序获得突变体。
利用 PCR 进行体外基因定点突变的基本原理是利用 PCR 的引物设计灵活性.在扩增中直接引入突变。首先设计引物,引物l用于导入突变位点,引物 2 与引物 1 的 5'-端邻接、3'-端方向相反;利用这对引物和高保真 Taq DNA 聚合酶,以双链质粒为模板进行 PCR 反应;对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理;再用连接试剂进行自身连接(环化反应);然后转化、提取突变体 DNA。


来源:《医学分子生物学实验技术》药立波第3版第5章

操作方法

利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变

利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物,使得新合成的 DNA 序列发生定点突变,经克隆测序获得突变体。原理利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变的基本原理是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物,使得新合成的 DNA 序列发生定点突变,经克隆测序获得突变体。

利用PCR进行单一位点的体外基因定点突变

利用 PCR 的引物设计灵活性.在扩增中直接引入突变。首先设计一对引物,引物l用于导入突变位点,引物 2 与引物 1 的 5'-端邻接、3'-端方向相反;利用这对引物和高保真 Taq DNA 聚合酶,以双链质粒为模板进行 PCR 反应;对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理;再用连接试剂进行自身连接(环化反应);然后转化、提取突变体 DNA。本方法操作方便简单,只需一天时间便可完成

利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变

在蛋白质结构功能研究中,有时需要在多个氨基酸位点同时制作突变。以往这样的突变很难实现,随着 PCR 技术的逐步发展,对 DNA 序列上多个位点同时突变成为可能。原理利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变的基本原理是利用 PCR 的引物设计灵活性,在扩增中直接引入突变。通过设计引物导入突变位点,和高保真 Taq DNA 聚合酶,以双链质粒为模板进行 PCR 反应;对 PCR 产物末端进行补平处理

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序