体外基因定点突变

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

体外基因突变技术分随机突变（random mutagenesis）和定点突变（site-directed mutagenesis）两类。定点突变常用技术包括：利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变、利用 PCR 进行体外基因定点突变。

原理

定点突变常用技术有：利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变、利用 PCR 进行体外基因定点突变。

利用 M13噬菌体进行体外基因定点突变的基本原理是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物，使得新合成的 DNA 序列发生定点突变，经克隆测序获得突变体。

利用 PCR 进行体外基因定点突变的基本原理是利用 PCR 的引物设计灵活性．在扩增中直接引入突变。首先设计引物，引物l用于导入突变位点，引物 2 与引物 1 的 5'-端邻接、3'-端方向相反；利用这对引物和高保真 Taq DNA 聚合酶，以双链质粒为模板进行 PCR 反应；对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理；再用连接试剂进行自身连接（环化反应）；然后转化、提取突变体 DNA。

来源：《医学分子生物学实验技术》药立波第3版第5章

操作方法

利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变

利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物，使得新合成的 DNA 序列发生定点突变，经克隆测序获得突变体。原理利用 M13 噬菌体进行体外基因定点突变的基本原理是在含有目的基因的 M13 单链噬菌体 DNA 复制过程中引入突变引物，使得新合成的 DNA 序列发生定点突变，经克隆测序获得突变体。

利用PCR进行单一位点的体外基因定点突变

利用 PCR 的引物设计灵活性．在扩增中直接引入突变。首先设计一对引物，引物l用于导入突变位点，引物 2 与引物 1 的 5'-端邻接、3'-端方向相反；利用这对引物和高保真 Taq DNA 聚合酶，以双链质粒为模板进行 PCR 反应；对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理；再用连接试剂进行自身连接（环化反应）；然后转化、提取突变体 DNA。本方法操作方便简单，只需一天时间便可完成

利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变

在蛋白质结构功能研究中，有时需要在多个氨基酸位点同时制作突变。以往这样的突变很难实现，随着 PCR 技术的逐步发展，对 DNA 序列上多个位点同时突变成为可能。原理利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变的基本原理是利用 PCR 的引物设计灵活性，在扩增中直接引入突变。通过设计引物导入突变位点，和高保真 Taq DNA 聚合酶，以双链质粒为模板进行 PCR 反应；对 PCR 产物末端进行补平处理