材料与仪器
目的蛋白
标准分子量蛋白
制胶板 电泳仪 染色液
标准分子量蛋白
制胶板 电泳仪 染色液
步骤
①将目的蛋白和标准分子量蛋白上样到同一块SDS-PAGE平板凝胶中,进行SDS-PAGE。
在同一块平板凝胶上进行目的蛋白和标准分子量蛋白的电泳,可以消除由于丙烯酰胺浓度和电泳条件不同而产生的差异。若要用此方法更精细地测定分子量,最好能采用不同浓度的丙烯酰胺凝胶(Ferguson,1964;Neville,1971)。关于在使用多种市售标准蛋白进行SDS-PAGE时,聚丙烯酰胺和交联剂两者浓度对蛋白迁移的影响,在Makowski和Ramsby(1997)中有详细讨论。
②电泳结束后,进行蛋白染色。
③(可选或不选)在测量尺F值之前干燥凝胶。
④测量蛋白和示踪染料(通常是溴酚蓝)迁移的距离。
⑤计算相对迁移率(Rf值):
RF=蛋白迁移的距离/示踪染料迁移的距离
⑥用迁移率对已知Mr的半对数作图。凝胶中部各点应几乎在一直线上(见图2.7)。
⑦通过未知蛋白的只F值从曲线图上读出未知蛋白的Mr。
要点:每块胶应重新绘制标准曲线。
来源:丁香实验