视神经横断模型及荧光金逆行标记

作为中枢神经的重要组成部分，视神经及其胞体已成为中枢神经损伤修复的重要研究对象。中枢神经损伤修复研究中的许多重大发现，最初都是以视神经损伤为模型开展的。其中最为著名的，是苏国辉和Aguayo采用周围神经移植诱发视网膜神经节细胞（以下简称节细胞）再生的开拓性研究。视神经由众多神经纤维组成，其胞体是位于视网膜层的节细胞，在模型制作过程中可分别将节细胞的胞体和轴突分开处理。视神经损伤模型制作简便，重复性好。视神经损伤后，节细胞会大扭死亡。因此，节细胞的保护及视神经再生是研究的两个重要方面。这个模型可以用来研究神经元保护及神经再生的过程及机制；另外此模型结合药物治疗及分子生物学检测方法可以为保护神经元及促进视神经再生的药物开发及机理研究提供一个很好的实验载体。两种可用于中枢神经元保护和轴突再生研究的视神经损伤模型，即视神经横断(optic nerve transection)及夹伤模型(optic nerve crush)。视神经横断模型为经典的模型，视神经保护研究只需要直接在视神经断端标记荧光金，而再生研究需要移植外周神经，并在外周神经断端标记荧光金。其特点是重复性好，但是研究再生时移植坐骨神经手术步骤较为复杂。视神经夹伤模型研究节细胞保护及再生实验需要在外侧膝状体和上丘进行荧光金标记。其特点是，模型制作简便，但是由于夹伤的力度较难控制，模型稳定性较差。这两种模型标记荧光金后都需要进行视网膜铺片。

(1)以1%戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。

(2)将大鼠固定于手术台上，沿中线切开头皮挂线旷置。

(3)手术显微镜下沿眶内缘小心分离左眶软组织，尽量向两眦延伸。

(4)依照解剖层次分别牵开眼外肌肉，充分暴露眼球后极和视神经眶内段。

(5)纵向切开视神经背侧鞘膜，注意避免伤及视网膜中央动脉。

(6)在眼球后极1.5mm处以显微剪剪断视神经。

(7)剪取小片封口膜并展薄，戳一小孔，容视神经残段通过，将一小块明胶海绵浸吸5%荧光金溶液，包埋视神经残段以逆行标记节细胞。将封口膜折叠包裹视神经残段及明胶海绵填塞于眶后。

(8)术毕缝合眼眶，以及头皮，并抗感染处理，调整头皮张力，可容双睑闭合。术中及术后检查手术侧眼底血供情况。

(9)术后相应时间点处死动物取眼球进行视网膜铺片。

结果：

1.在手术过程中以及术后注意观察眼底是否出血或者缺血，造成这两者原因主要为眼损伤或剪断视网膜中央动脉，出现这两种情况的动物均不能用于后续试验。

2.在视网膜铺片后进行显微镜下观察，荧光金标记清楚，无未标上的区域，表明荧光金逆行标记试验成功（图4-12)。

3.荧光金标记的节细胞胞体多呈卵圆形，边界清晰，大小不一；其分布由中央向周边部逐渐稀少；在损伤2d后逐渐开始出现标记的小胶质细胞，为吞噬了死亡的节细胞而成金黄色，其形态为胞体细长，形态不规则，较易与节细胞区分开来。

1.造模过程中不要损伤视网膜中央动脉，视网膜中央动脉损伤会导致节细胞快速死亡。

2.造模过程中不要损伤视神经，切开视网膜背部鞘膜、剪断视神经、夹伤视神经过程中除损伤部位外其他部位不要用摄子夹持，需要固定视神经时，应夹住视神经根部鞘膜。

1通常麻醉大鼠，切开头皮后，在大鼠两眺对称靠外两侧分别挂两根线以保证手术视野清晰可见，此时挂线不好有可能会妨碍手术过程中的视野。出现此问题可以反复调整挂线，直到手术视野清晰可见为止。

2.分开眼外肌肉时务必沿着解剖层次分离，通常将外斜肌和上直肌分开可见静脉窦；挂线分开眼外肌肉后会清晰可见一侧静脉窦，此静脉窦可以作为标志物，视神经在其前下方，分开前下方的眼外肌肉便可看到视神经。

3.视网膜中央动脉在视神经0.5mm以前走行于视神经内，而在0.5mm后走行于视神经鞘膜内。因此为了防止损伤视网膜中央动脉，最短夹伤或剪断视神经的长度应为0.5mm,并且应该切开视神经鞘膜，夹伤或剪断视神经时应从鞘膜上夹伤或剪断视神经，防止损伤鞘膜上的视网膜中动脉。

4.手术中使用的显微器械对手术的成败非常关键，尤其要保证分离视神经用的摄子及用于划开视神经鞘膜的维纳斯剪尖端尽量不受磨损。根据摄子尖端的不同粗细，选择性的用于分离头皮、肌肉和神经。手术需要反复练习。

5.荧光金标记的成功由多个步骤控制着。首先视神经残端包裹荧光金时，封口膜裁剪的大小要适中，避免过大或过小；膜中央用于插入视神经的空洞宁小勿大，否则容易造成明胶海绵的脱落。沾荧光金的明胶海绵不能太大，太大容易造成脱落。荧光金容易光照猝灭，在视网膜铺片时应避光。

6.开展视网膜铺片实验时，取出眼球后往往分不清楚眼睛的鼻侧或颞侧，因此在取眼球时可以在鼻侧用小针头扎一小眼，取出眼球后沿小眼剪－短切口，分离视网膜后在其对侧及上下侧分别剪一切口，这样便可容易分清四个象限（左上为鼻上，左下为鼻下，右上为颞上，右下为颞下）。