基本方案

用 1 mm 直径的玻璃珠，通过与硅烷成分的反应来实现玻璃表面的活化，从而引入氨基。通过对硝基苯酰氯化物的进一步修饰，硝基被加到氨基上，氨基和亚硝基一起被转变为阳离子重盐，酶通过酪氨酰残基被连接（图 1）。

图 1　硅烷化玻璃表面和共价固定化酶。Ⅰ 硅烷化玻璃表面的 Si-OH 基团用 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷（3-aminopropyl-triethoxysilane）；Ⅱ 通过 p-硝基苯酰氯化物衍生氨末端；Ⅲ 用连二亚硫酸钠减少硝基；Ⅳ 用亚硝酸形成阳离子重盐；Ⅴ 酶通过酪胺酰残基被连接

1. 玻璃珠的活性

玻璃珠（10 g）在 40 ml 5％ 硝酸中 80～90℃ 加热 1 h。其后珠子用蒸馏水洗三次，并被转移到 PE 容器中避免硅烷化和酶固定到长颈瓶的壁上。添加水（10 ml）和 3 g 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷，pH 先用浓 HCl 调节，最终用 2 mol/L 的 HCl 将 pH 调到 3～4，用 pH 指示纸来检测（pH 电极会被损坏）。反应的混合物在 65℃ 中孵化 12 h，之后珠子在吸滤器（瓷器，无玻璃粉）上用水冲洗 5 次，用丙酮冲洗 3 次（每次 20 ml）。最后珠子在 55℃ 干燥 20 min。

2. 重氮化作用

后面的程序必须用玻璃容器。为了玻璃珠子的活化，添加 25 ml 二氯甲醇、1.5 g 三乙胺和 5 g 对硝基苯酰氯化物，回流煮沸 4 h，要避免潮湿。珠子用 10 ml 二氯甲醇冲洗 3 次，在 55℃ 短暂干燥。之后为了自由氨基的重氮化作用，这些珠子被转移到含 1 g NaNO₂ 的 100 ml 2 mol/L HCl 溶液中，在室温静置 20 min。用水剧烈地冲洗珠子后，将珠子在 40 ml 含 2 g 连二亚硫酸钠的 40 ml 水溶液中回流 lh。芳基胺珠子形成，用 20 ml 的水冲洗三次，转移到圆底的长颈瓶中，添加 88 ml 的 2 mol/L HCl。长颈瓶被安装在旋转的脱水器上，在冰浴中旋转，保证在 0℃ 冰浴。在 20 min 内，将 1.12 g 的 NaNO₂ 慢慢地添加一部分，在其间长颈瓶在非真空状态下一直转动，在添加了最后一部分之后，长颈瓶必须用一个弱的喷水式真空推进器旋转 10 min（大约 20 mbar），用于排出含氮气体。产生的重氮基玻璃用 20 ml 的冰水冲洗 3 次，之后必须马上用于固定。在用于固定之前的这段时间必须保存于 4℃。

3. 酶的固定

酶溶液（10 mg 溶于 10 ml 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾）被添加到玻璃珠子中，长颈瓶在 4℃缓慢旋转过夜（12～16 h）。其后玻璃珠子用 5 ml 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸钾缓冲液冲洗 3 次。浮在表面的缓冲溶液被收集，用来决定未被固定的蛋白质和酶的活性，用这种方法来评估固定的效率

在操作中一定要注意有毒试剂和侵蚀性试剂。避免使用磁力搅拌器，因为它会损坏玻璃表面的修饰。