基本方案

钙离子是一种重要的细胞内第二信使，参与许多重要的细胞生理活动和病理过程，因此监测细胞内钙离子水平的变化对了解细胞的活动状态非常重要。细胞内钙成像技术是通过向细胞内载入钙指示剂，利用钙指示剂与钙结合后发生荧光强度或波谱性质改变的特征来监测胞内钙离子浓度的变化。目前常用的钙指示剂主要是化学荧光指示剂，如Fura-2,Fluo-3等。其中Fura-2为比值型指示剂，它在钙游离和钙结合状态下发生光谱性质的改变，如在钙结合状态下它的激发波峰由363nm变为335nm,而发射波峰无明显变化，因此通常采用双波长(340nm和380nm)两次相继激发，激发后所得到的发射光强之比即为钙信号的相对值（图3-12)。因Fura-2的数据结果采取比值的方式，因此不受实验设备、指示剂的负载浓度、细胞类型和实验者个体操作等的限制，同时还可以消除细胞的厚薄变化、指示剂在胞内的重新分布变化等因素的影响，真实地反映细胞内钙们号的变化。因此Fura-2是目前应用最为广泛的化学荧光钙指示剂。

1.培养细胞钙成像：

(1)标本制备大鼠或小鼠颈椎脱臼致死或缺氧致死，取材、分离打散细胞然后对其进行培养3-7d。

(2)Fura-2AM溶液制备将Fura-2AM首先溶解在DMSO中制备成1OmM的储备液，然后分装置于-20℃。在当日实验时将1OmM的Fura-2AM与助扩散剂PluronicacidF-127(20%)溶解在Ringer液中，具体配方如表3-l。

(3)iura-2AM负载细胞将上述配置好的Fura-2AM溶液加入培养细胞(24孔板）中室温孵育30min,之后吸出Fura-2AM溶液加入正常Ringer液洗脱30min,待用。整个过程中24孔板外用锡箔纸包被注意避光。

(4)培养细胞钙成像将Fura-2负载后的细胞置入荧光显微镜载物台上，相继应用340nm和380nm的激发波长各曝光30s,曝光频率为1Hz,计算F340/F380比值代表相对钙水平。灌流给予某种可以诱发胞内钙升高的激动剂时，便可以观察到荧光强度的改变，具体表现为340nm激发波长下的荧光强度增加，而380nm激发波长下的荧光强度减弱，因此F340/F380比值增大•.

2.急性组织薄片钙成像；

(I)标本制备大鼠或小鼠腹腔注射乌拉坦麻醉后，取材，在振动切片机上切取350-450µm厚的组织薄片（脊髓片或脑片），置于通有95%02和5%C02的混合气的人工脑脊液中孵育。

(2)Fura-2AM(1OµM)溶液制备同上，将Fura-2AM首先溶解在DMSO中制备成1OmM的储备液，然后分装置于-20℃。在当日实验时将1OmM的Fura-2AM与助扩散剂PluronicacidF-127(20%)溶解在人工脑脊液(ACSF)中，具体配方如表3-2。

(3)Fura-2AM负载细胞将组织薄片（脊髓片或脑片）放置在上述配制好的Fura-2溶液中孵育45min,负载完成后将其放置在无Fura-2的正常人工脑脊液中洗脱30min,然后开始进行钙测定。注意整个过程中持续通95%02和5%CO2的混合气体，并且在避光下进行。

(4)组织薄片钙成像将Fura-2负载后的组织薄片（脊髓片或脑片）置人荧光显微镜载物台上，相继应用340nm和380nm的激发波长各曝光30ms,曝光频率为1Hz,计算F340/F380比值代表相对钙水平。如彩页图3-14所示，电刺激背根后诱发脊髓背角浅层区域细胞的钙水平显著升高，具体表现为340nm激发波长下的荧光强度增加，而380nm激发波长下的荧光强度减弱，因此F340/F380比值增大。

1.为避免或减少荧光淬灭，所有操作程序需在避光下进行。

2.因Fura-2AM在脱脂的过程中会产酸，因此需要在溶液中加入HEPES以维持pH值的稳定。否则，过酸会导致细胞死亡。

1在Fura-2AM负载前观察细胞或组织薄片的状态，其状态的好坏决定了Fura-2AM负载的效率。温度对Fura-2AM负载的效率没有绝对影响，室温或33℃-37℃下负载均可。Fura-2AM负载细胞时间控制在30-60min为宜。在配置Fura-2AM溶液的过程中加入HEPES尤其重要，因为Fura-2AM在穿过细胞膜被酯酶剪切形成Fura-2的过程中会产酸，因此需要在溶液中加入HEPES以维持pH值的稳定。否则，过酸会导致细胞死亡。在应用340nm和380nm激发波长相继激发荧光时，曝光时间一般为10-50ms,曝光时间过长容易引起荧光淬灭。在钙指示剂负载脊髓薄片或脑片组织过程中，最好持续通有混合气体，以保证良好的细胞状态。

2除了上述通过孵育的方式将酯质化的钙指示剂Fura-2负载入细胞内进行钙测定外，还可以应用微电极将钙指示剂直接载入细胞内。这一方法是与电生理膜片钳技术相结合的钙测定所普遍采用的负载方法。将指示剂溶解在电极内液中，在对细胞形成全细胞记录后，指示剂通过低阻抗电极尖端被动地扩散至细胞内。利用这种方法负载指示剂，可以针对任何一种指示剂形式。指示剂负载入细胞后，钙测定程序同上所述。