聚丙烯酰胺凝胶法

聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由丙烯酰胺单体和交联剂亚甲基双丙烯酰胺，在引发剂过硫酸胺（AP）提供自由基和催化剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合而成。丙烯酰胺可由天然光线诱发聚合，所以其水溶液应贮藏在棕色瓶中，置低温 4℃ 更佳。由于其水溶液稳定性较差，通常 2 个月内用完为好。10％ 过硫酸胺（100 mg 溶于 1 ml ddH₂O 中）应 4℃ 保存，两星期内用完。聚丙烯酰胺凝胶浓度和 DNA 分离范围、指示剂显示范围见表 13-3。

由于 IgH 和 TCR 的 PCR 产物在 50～250 bp 之间，用 12％ 的聚丙烯酰胺为佳。

30％ 聚丙烯酰胺的配制：29 g 丙烯酰胺，1 g 亚甲基双丙烯酰胺（丙烯酰胺：亚甲基双内烯酰胺的分子比为 29:1），加 ddH20 至 100 ml，避光，4℃ 保存（丙烯酰胺有神经毒性，避免呼吸进入体内）。

1. 制胶

1.1 灌胶玻璃板清洗去污剂洗涤，自来水冲净，蒸馏水漂洗，烘干，乙醇浸泡，擦干备用或涂抹硅胶。

1.2 隔条长玻璃和短玻璃板配对放入制胶架内，上紧制胶架，再将制胶架放在固定架夹上夹紧，倒入现配制的 12％ 聚丙烯酰胺凝胶溶液（ddH2O 48 ml，10× TBE 10 ml，30％ 丙烯酰胺 40 ml，10％ 过硫酸铵 1.85 ml，四甲基乙二胺 0.15 ml），插入梳子，勿使梳子齿下进气泡，10 min 左右可凝固。

1.3 凝固后垂直向上小心提出梳子，放开固定架夹于，取下制胶架松开胶架，再取下凝胶玻璃板；用注射器吸蒸馏水冲洗孔格，以防梳子取出后未聚合的溶液溶入孔格内再聚合而使孔底形状不整齐，并导致电泳带型不整齐。然后将凝胶玻璃板成双并面对面固定在移胶架上，放入电泳槽中。槽内电泳液为 1 × TBE。

[10 × TBE 电泳缓冲液配制：108 g Tris 碱，55 g 硼酸，40 ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）加水定容至 1 L；常温下保存]。

2. 电泳

2.1 电压 1～8 V/cm，电压过高将引起升温，导致 DNA 带型弯曲，甚至小片段 DNA 解链。电流应为 90～180 mA。

2.2 上样 4 μl PCR 产物+1 μl 上样缓冲液（0.25％ 溴酚蓝，0.25％ 二甲苯青 FF，30％ 甘油水溶液；4℃ 保存）混合后用细长吸头打入孔中，DNA 相对分子质量标准（Marker）用 pBR 322 DNA/HaeIII（8～587 bp）。1 μl Marker + 1 μl 上样液+2 μl 1×TBE 混合后打入孔中，根据上样缓冲液中含有指示剂迁移距离，判定电泳的终止时间。停止电泳后，取出玻璃板用制胶铲轻撬开长短玻璃板，用制胶铲轻轻分离凝胶，放入盛有 ddH₂Ｏ 的玻璃器中，清洗 2 遍，倒去 ddH₂Ｏ。

3. 银染

以下各步骤均在摇床上进行。

3.1 固定向清洗过 2 遍的含凝胶玻璃皿注入 10％ 乙醇，固定 10 min；倒去固定液；用 ddH₂Ｏ 洗 2 遍，倒去 ddH₂Ｏ。

3.2 脱色 1％ 硝酸液脱色 10 min，倒去脱色液，用 ddH₂Ｏ 洗 2 遍并倒去 ddH₂Ｏ。

3.3 染色 0.2％ AgN03 液染色 20 min，倒去染色液，用 ddH₂Ｏ 洗 2 遍以上并倒去 ddH₂Ｏ。

3.4 显色加显色液，直至认为条带满意为止，用 ddH₂Ｏ 洗 2 遍，自来水冲洗或放入 10％ 乙酸乙醇终止液中存放。（显色液：Na₂CO₃ 30 g，甲醛 1 ml，1％ Na₂S₂O₃ 0.1 ml，加 ddH₂Ｏ 定容至 1 L；常温保存。）

3.5 存档凝胶摄录系统或数码相机拍照存档。