基本方案

分离线粒体DNA和叶绿体DNA的原理是基本一致的。本方法首先是分离完整的细胞器,然后从细胞器中提取DNA。要获得高纯度的细胞器DNA,关键是要把所要的细胞器与其他亚细胞结构分离开来,这可以通过差速离心或梯度离心来完成。完整的细胞器经裂解后,可以通过CsCl离心或酚-氯仿抽提获得DNA。在裂解细胞器之前常用DNase清除非细胞器的DNA。本实验采用匀浆法先将线粒体从细胞中分离出来,再使线粒体发生裂解,释放出DNA、蛋白质等,经酚抽提后即可得到提纯的mtDNA。

以下所有操作除特别指明外,均在4℃进行,将研钵、研棒和离心管预冷,使用冷藏的缓冲液并在冰桶中操作。

1.剪取幼嫩叶片,用1%次氯酸钠溶液消毒15min,无菌水冲洗3次,再将其剪成约1cm²的碎片。

2.按每克材料10ml研磨缓冲液的比例加入研磨缓冲液,在研钵中将叶片研磨成匀浆。用6层纱布过滤,并收集滤液。

3.滤液于4℃,3000r/min离心15min,收集上清液。

4.上清液于4℃,10000r/min离心25min,弃上清液。

5.沉淀用缓冲液A(不加β-巯基乙醇、BSA和PVP)悬浮,并重复4、5两步骤,收集的沉淀即为粗线粒体。

6.加入MgCl₂至终浓度为5mmol/L,加入DNaseⅠ至终浓度为30μg/ml,冰浴1h后加Na₂EDTA至终浓度为15mmol/L以终止DNA酶解反应。

7.将粗线粒体铺于不连续浓度的蔗糖梯度上(蔗糖浓度由上至下依次为20%、40%、52%、60%,体积依次为7ml、10ml、10ml、7ml,由缓冲液C配制)。4℃,20000r/min超速离心2.5h,吸取40%与52%蔗糖界面的线粒体。

8.在线粒体吸取物中加入4倍体积的缓冲液B。4℃,10000r/min离心15min。所得沉淀即为纯净、完整且表面无核DNA污染的线粒体。

9.将线粒体悬浮于裂解缓冲液中,加入1/10体积的10%SDS和1/100体积的30mg/mlRNase液,50℃水浴30min。

10.加入1/150体积的25mg/ml的蛋白酶K,37℃水浴30min。

11.依次用苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿抽提DNA。

12.加1/10体积3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇,混匀,-20℃放置至少30min,然后用微型离心机4℃、13000r/min离心15min,收集DNA。

13.沉淀DNA用75%乙醇洗2～3次。

14.DNA沉淀于空气中干燥后溶于少量TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LNa₂EDTA,pH8.0)中。-20℃保存备用。

具体试剂描述：

缓冲液A(研磨缓冲液)(0.4 mol/L甘露醇,50 mmol/L Tris-HCl,1mmol/L Na₂EDTA,5 mmol/L KCl,pH7.5;使用前加入2 mmol/L β-巯基乙醇,0.1%BSA,10 mg/ml聚乙烯吡咯烷酮),缓冲液B(0.2 mol/L甘露醇,10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L Na₂EDTA,pH7.2),缓冲液C(1 mmol/L Na₂EDTA,15 mmol/L Tris-HCl,pH7.2),蛋白酶K(25 mg/ml),蔗糖(20%、40%、52%、60%),MgCl₂(0.1 mol/L),DNaseI(2 mg/ml,溶于水),TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/LNa₂EDTA,pH8.0),SDS(10%),RNase(30 mg/ml),乙酸钠(3 mol/L),乙醇,苯酚,氯仿,异戊醇。