原理
双向免疫扩散试验不仅可对抗原或抗体进行定性鉴定和测定效价，还可对抗原或抗体进行纯度分析和同时对两种不同来源的抗原或抗体进行比较，分析其所含成分的异同。
若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线（图 1）。因此，利用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。
图 1 双向免疫扩散平板所表现的沉淀线数量
A. 单个抗原抗体系统
B. 多个抗原抗体系统
沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远（图 2），因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之固定抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。
图 2 双向免疫扩散平板中表现的沉淀线与各抗原孔的不同距离
Ab：抗体，周围孔为抗原
此外观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分（图 3）。假如同样的纯抗原 a 放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原 a 和 b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分 a 和 ab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。
图 3 双向免疫扩散平板中沉淀线的类型
A. 相邻两孔的抗原相同；B. 抗原不同；C. 抗原有部分相同
材料与仪器
兔抗马血清 马血清 牛血清 山羊血清 人血清
1％ 离子琼脂
方阵型打孔器或单孔金属管（孔径约 3 mm） 吸管 毛细滴管 2.5×7 cm 载玻片、注射针头 含湿滤纸或湿纱布的培养皿或带盖搪瓷盒
步骤
1. 在沸水浴中溶解 1％ 离子琼脂。
2. 冷至 50～60℃ 左右，吸 3.5～4 ml 加在载玻片（必须放在水平位置）上，使其均匀布满玻片而又不流失。
3. 琼脂凝固后，取方阵型打孔器打孔，或单孔金属管按图 4 打孔，再用注射针头挑去孔中琼脂，每琼脂板打两个方阵型。
图 4 双向扩散型
孔径约 3 mm；与中央孔的距离 5～6 mm
4. 用记号笔在琼脂板的底面将孔编号。
5. 用毛细滴管加兔抗马血清抗体于两个方阵型的中央孔中，第一方阵型的周围孔 1 加牛血清，孔 2 加马血清，孔 3 加羊血清，孔 4 加入血清。第二方阵型周围各孔加入的抗原与第一方阵型相同，但浓度均改为 1：20。
6. 将玻片放入有湿滤纸的培养板或有盖搪瓷盒内。
7. 置37 ℃ 温箱，24～48 h 后取出观察结果。
注意事项
所加血清与抗血清不能溢出孔外。
来源：丁香实验
