基本方案

λDNA是线状双链DNA,EcoRⅠ在其上有5个切点,产生6个片段,通过琼脂糖凝胶电泳可将这几条片段分离开。如何重建这6个片段呢?可用两种限制性内切酶同时或先后作用于λDNA。例如λDNA经EcoRⅠ切割后在凝胶上分离开来的6条带可洗脱出来,然后分别将这6条片段用HindⅢ切割。结果表明片段1上没有HindⅢ酶切点,而片段2上有2个HindⅢ切点,完整线状λDNA上有6个HindⅡ酶切点产生7条片段。根据片段大小和酶切点之间关系可作出初步的限制性内切酶图谱。将限制性内切酶图谱转化为基因排列图,最常用的方法是Southernblot,即将电泳后的酶切片段与特殊基因DNA或其RNA探针杂交,从而将此基因定位于一定的酶切片段上。

(一)λDNA-EcoRⅠ酶解反应

1.取一无菌新Eppendorf管依次加入16μL无菌去离子水、2μL 10×EcoRⅠ缓冲液、1μL EcoRⅠ酶,最后加入λDNA1μL(总反应体积为20μL),此为小量酶解反应体系,主要用于酶切鉴定。如需制备基因片段,可选用大量酶解反应体系,反应体积为50～100μL,相应扩大各种试剂的加入量。

2.轻轻地将Eppendorf管中反应试剂混合均匀,置37℃水浴保温1～1.5h后终止反应(根据不同酶说明书的要求)。

3.取出样品进行适当浓度的琼脂糖凝胶电泳(考虑到要从凝胶中回收DNA,可选用低熔点琼脂糖制胶)。

(二)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

1.在长波紫外灯下小心切下含有待回收DNA片段的凝胶装入Eppendorf管中。

2.将Eppendorf管中凝胶轻轻弄碎,加入2～5倍体积的TE缓冲液,置65℃保温10min,取出冷却至室温。

3.取出回收管,加入等体积的饱和酚充分混匀后经4000×g离心10min。

4.取水相于另一Eppendorf管中,再用等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)混合物提取一次。

5.经4000×g离心10min后将上清液转入另一新Eppendorf管中,加入0.2倍体积的10moL/L乙酸铵和2倍体积的冷乙醇,混匀后室温静置10min。

6.经12000×g,4℃离心20min。弃上清液,用70%乙醇淋洗两次;将DNA样品置于65℃烘5～10min至干燥,加入适量的TE缓冲液或无菌去离子水溶解DNA。

7.取少量溶解的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,检测回收DNA的纯度与浓度。

8.同样方法回收其他5个DNA片段。

(三)λDNA-HindⅢ酶解反应

1.取一无菌新Eppendorf管,依次加入13～15μL双蒸水、2μL 10×HindⅢ缓冲液、1μLHindⅢ酶,最后加入λDNA-EcoRⅠ酶解后回收的一个片段DNA10μL。同样取5只Eppendorf管,做成其他5个片段的HindⅢ酶反应系统。

2.将酶切反应系统轻轻混匀后,置于37℃水浴保温1～1.5h后终止反应。

3.取适量样品用于琼脂糖凝胶电泳分析。同时用λDNA/EcoRⅠ标准品、λDNA/HindⅢ标准品、λDNA/(EcoRⅠ+HindⅢ)标准品对照。

(四)λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ双酶解反应

双酶解反应在两个酶反应条件相同或相近时,可参照小量酶解反应进行。当反应条件不同,例如缓冲液NaCL浓度要求相差太远时,酶活性受到抑制,需分别进行酶解反应,可从低盐到高盐的次序进行。先用低盐缓冲液进行相应的酶解反应,再补加NaCL,同时将反应体积扩大至30μL。如果不用这种方法,可采用乙醇沉淀法,将已被一种酶降解的DNA沉淀后,重新建立反应体系。每种限制性内切酶都有其最佳反应条件,一般来说,标定酶单位的条件就是反应的标准条件。各限制性内切酶产品往往对同一种酶也推荐使用不同的反应条件,因此建议按照产品说明书进行操作。本实验采用乙醇沉淀法,先沉淀被一种酶酶解的DNA,然后重建反应体系。

1.取一无菌新Eppendorf管,依次加入16μL无菌去离子水、2μL10×EcoRⅠ缓冲液、1μLEcoRⅠ酶,最后加入λDNA1μL,轻轻混合均匀。

2.将样品液置于37℃水浴保温1～1.5h后终止反应。

3.用乙醇沉淀法将已被一种酶酶解的DNA沉淀。

4.加入无菌去离子水17μL,使沉淀干燥后的DNA溶解。

5.在DNA样品液依次加入2μL10×HindⅢ缓冲液和1μLHindⅢ酶。

6.轻轻混匀后,置37℃水浴保温1～1.5h后终止反应。

7.取适量的酶切样品进行琼脂糖凝胶电泳。同时用λDNA/EcoRⅠ标准品、λDNA/HindⅢ标准品、λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ标准品作为对照。

1.操作步骤中提出的DNA和酶的加入量可依不同产品批次进行调整,反应总体积不变。

2.一般最后加入DNA样品,以免操作不当引起试剂污染。

3.用微量进样器加样时每次要更换枪头(除先加水外),避免交叉污染。

4.当样品加入反应管后要将Eppendorf管盖上,以免保温时水蒸气进入管内。