基本方案

亚硝基胍(NG、NTG)是一种广泛使用的强诱变剂。它主要在DNA链的复制区引起GC→AT的转换,即使在致死率很低的条件下也能对微生物产生高频率的突变。本实验利用亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变后,通过点种法检测出营养缺陷型,再经生长谱法进行鉴定,获取营养缺陷型菌株,并确定其营养缺陷的具体物质。

(一)诱变处理

1.菌悬液的制备

挑取少许斜面菌种接入5mlCB培养液中,置30℃振荡(200r/min)培养8h,取0.5ml培养物转入另一5ml CB培养液中,继续振荡培养过夜。取过夜培养物经4000r/min离心8min,弃去上清液;先加入1ml的柠檬酸缓冲液(pH5.5)于离心管中搅匀沉淀物,再加4ml同样的缓冲液制成菌悬液;经4000r/min离心8min,如此反复将菌体洗涤两次,最后加入5ml上述缓冲液制成菌悬液(约10⁸个/ml)。

2.亚硝基胍诱变处理

取2支无菌小试管分别加入2ml菌悬液,置37℃水浴预热。其中一支小心地加入50μl NTG溶液(原始浓度为2mg/ml),混合均匀,将两支试管同时置37℃水浴保温30min。取出两支保温的试管经4000r/min离心8min,小心弃去上清液(上清液放在盛有1mol/L NaOH溶液的器皿中,切勿将含有NTG的上清液滴在皮肤或衣物上),分别加入5ml磷酸缓冲液(pH7.0)制成菌悬浮液,再离心8min,如此反复洗涤两次,最后加入2ml磷酸缓冲液制成菌悬液。分别取2种菌悬液各0.5ml按10倍稀释法将菌悬液稀释至10^-6,分别取10^-4,10^-5和10^-6稀释液涂布在CB平板上,每稀释度涂布9皿;同样取未经诱变处理的菌液稀释后每稀释度涂布3皿作为对照;置30℃培养2d。统计平板上的CFU数,计算杀菌率。平板上的菌落将用于检出的菌落。

(二)营养缺陷型的检出

1.点种法

取基本培养基(MM)和完全培养基(CB)平板,用记号笔在平板底部做相对应的标记(即一套MM平板和一套CB平板相对应)。将事先已编号的格子纸(见图23-1)分别放在对应平板的底部。用无菌牙签小心地在待测菌落表面蘸取少许菌苔,分别点在MM和CB平板对应位置上(先点MM平板,后点CB平板。尽可能多挑选菌落),置30℃培养2d。

2.影印法

取MM、CB平板各1皿,在平板底部画箭头作为方向标记。选择菌落分散的平板作为母平板,同样标记方向,无菌影印板上也做方向标记。按标记的方向将母平板倒放在影印板的绒布上,然后取出影印板,按同样的方法将MM平板倒放在影印板上,取下MM平板,同样将影印板上的细胞印在CB平板上。成对的影印平板置30℃培养2d。

3.夹层法

取无菌培养皿3皿,各倒一薄层(约5ml)MM培养基,凝固后加入0.1ml经诱变处理的10^-5稀释菌液,再倒入约5ml的MM培养基(熔化后稍冷,不烫手即可,温度约45℃),摇匀,待凝固后再加上一层约5ml的MM培养基,凝固后置30℃培养2d。在上述平板底部将长出的菌落做上记号,统计其菌落数,再加上一层约5ml的半固体CB培养基,置30℃培养2d。

上述三种方法中,在MM培养基上不能生长,而在CB平板上相对应位置生长的菌落需要进一步复证是否为真正的营养缺陷型。将这些可能为缺陷型的菌落编号,分别对应接种在MM斜面和CB斜面上,置30℃培养2d。将在MM斜面上不长,而在CB斜面上生长的菌种保存,供进一步鉴定用。

(三)营养缺陷型的鉴定

1.初步测定

轻轻挑取一环待测菌种于0.5ml生理盐水中,振荡制成菌悬液。取0.1ml上述菌悬液均匀涂布在MM平板上。待干后在平板底部按图23-2分成三个区域,并分别标上A、V和B。用无菌牙签分别挑取营养混合物轻轻放在相应的区域中央(不过于偏向平板中央或边缘),置30℃培养2d后根据三个区域的生长情况确定其所属营养缺陷的类别。

2.准确鉴定

按上述方法将初步测定的缺陷型菌株制成菌悬液,涂布在MM平板上。在平板底部划分区域(划分的区域数和需添加的生长因素编组数相同)。按区域对应地加入少许编组营养物质混合物,置30℃培养2d后观察结果。

1.将接触过亚硝基胍的所有器具放在通风处,用1mol/L NaOH溶液浸泡,使残余的亚硝基胍分解破坏,然后用水清洗干净。

2.影印和鉴定缺陷型菌株时,MM和CB培养基上的生长情况要及时对照观察,以免影响结果判断的准确性。

3.初步鉴定和准确鉴定时菌液细胞密度可略高,能使待测菌均匀地分布在培养基表面。