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梯度胶凝胶电泳

最新修订时间:

原理

在凝胶电泳中使用丙烯酰胺梯度胶比使用线性胶有两大优点。一是在高浓度丙烯酰胺条件下可以增加蛋白质的分子筛作用,从而使低分子量蛋白质形成淸晰的条带。另一是梯度胶可以在块胶内分离分子量范围更大的蛋白质(如 5%~20% 的凝胶可以分离 15 kDa~200 kDa 的蛋白质;而 3%~30% 的凝胶可以分离 13~950 kDa 的蛋白质)。丙烯酰胺在梯度胶中的百分比可根据需要来定。

材料与仪器

蛋白质溶液
梯度仪 蠕动泵 连接管

步骤

1. 工作溶液


1.1.1 溶液 A

30% 丙烯酰胺,0.8% 双丙烯酰胺


1.1.1 溶液 B

15 mol/L Tris-HCl(pH 8.8),0.4% SDS


1.1.3 溶液 C

0.5 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.4% SDS


2. 5%~20% 分离胶所需的溶液量


3. 制备分离胶

灌制丙烯酰胺梯度胶与线性胶最大的区别在于需要使用梯度仪。恰好在分离胶溶液灌入凝胶模具之前,梯度仪将高浓度和低浓度的丙烯酰胺溶液相混合,在没有蠕动泵的情况下,凝胶溶液依靠重力灌入模具内。高浓度丙烯酰胺溶液内加入蔗糖可以稳定梯度的形成。


3.1 准备好凝胶模具,并装配好梯度混合器。磁力搅拌器置于梯度混合器的下方,这样就不会使混合器的凝胶槽内产热。调节蠕动泵至流速为 3 ml/min;


3.2 准备好未加 TEMED 的分离胶溶液;


3.3 将 TEMED 加至分离胶溶液内,轻轻搅拌混匀,此时动作要迅速,因为凝胶很快会聚合;


3.4 将适量的两种分离胶溶液分别加人到混合器的两个凝胶槽中(例:对于 10 ml 的凝胶,各加 5 ml 至每个槽屮高百分比浓度的丙烯酰胺溶液应加入至 B 槽中;


3.5 打开磁力搅拌器,接通两个槽之间的连通管;


3.6 打开蠕动泵,形成梯度胶;


3.7 当分离胶灌完后,在胶的顶部轻轻覆盖约 1~5 mm 的水层;


3.8 用清水冲洗梯度混合器和连接管,防止残留的丙烯酰胺聚合后堵塞;


3.9 堆积胶的制备。(参见SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)

注意事项

1. 堵塞在连通管中或梯度仪凝胶槽中的气泡致使形成的梯度不均一。


2. 凝胶溶液放在冰箱 4℃ 预冷,可以延缓灌胶时凝胶聚合的时间。


3. 为了延缓梯度凝胶聚合的时间,可用核黄素來替代过硫酸铵。核黄素的终浓度为 0.0005%(储存液浓度为 0.004%),将凝胶暴露于日光,或白色、蓝色的荧光下即可聚合。

来源:丁香实验

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