梯度胶凝胶电泳
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原理
材料与仪器
梯度仪 蠕动泵 连接管
步骤
1.1.1 溶液 A
30% 丙烯酰胺,0.8% 双丙烯酰胺
1.1.1 溶液 B
15 mol/L Tris-HCl(pH 8.8),0.4% SDS
1.1.3 溶液 C
0.5 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.4% SDS
2. 5%~20% 分离胶所需的溶液量
3. 制备分离胶
灌制丙烯酰胺梯度胶与线性胶最大的区别在于需要使用梯度仪。恰好在分离胶溶液灌入凝胶模具之前,梯度仪将高浓度和低浓度的丙烯酰胺溶液相混合,在没有蠕动泵的情况下,凝胶溶液依靠重力灌入模具内。高浓度丙烯酰胺溶液内加入蔗糖可以稳定梯度的形成。
3.1 准备好凝胶模具,并装配好梯度混合器。磁力搅拌器置于梯度混合器的下方,这样就不会使混合器的凝胶槽内产热。调节蠕动泵至流速为 3 ml/min;
3.2 准备好未加 TEMED 的分离胶溶液;
3.3 将 TEMED 加至分离胶溶液内,轻轻搅拌混匀,此时动作要迅速,因为凝胶很快会聚合;
3.4 将适量的两种分离胶溶液分别加人到混合器的两个凝胶槽中(例:对于 10 ml 的凝胶,各加 5 ml 至每个槽屮高百分比浓度的丙烯酰胺溶液应加入至 B 槽中;
3.5 打开磁力搅拌器,接通两个槽之间的连通管;
3.6 打开蠕动泵,形成梯度胶;
3.7 当分离胶灌完后,在胶的顶部轻轻覆盖约 1~5 mm 的水层;
3.8 用清水冲洗梯度混合器和连接管,防止残留的丙烯酰胺聚合后堵塞;
3.9 堆积胶的制备。(参见SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
注意事项
2. 凝胶溶液放在冰箱 4℃ 预冷,可以延缓灌胶时凝胶聚合的时间。
3. 为了延缓梯度凝胶聚合的时间,可用核黄素來替代过硫酸铵。核黄素的终浓度为 0.0005%(储存液浓度为 0.004%),将凝胶暴露于日光,或白色、蓝色的荧光下即可聚合。
来源:丁香实验