原理
材料与仪器
A 和 B 类细胞的双链 cDNA （ds cDNA）
ALuI RsaI ATP T4 多聚核苷酸激酶及其缓冲液 DNA连接酶和及其缓冲液 Taq DNA聚合酶及其缓冲液 寡核苷酸引物 4dNTP 混合物 驱动 dNTP 混合物 转化感受态菌株 HEPES缓冲液 链霉亲和素溶液 差减杂交缓冲液 聚乙二醇 8000 苯酚 氯仿 氯仿 矿物油 乙醇 MgCl2 NaCl
放射性标记的差减探针 PCR 管 微量离心管 离子交换PCR离心柱 Sephacryl S-300 离心柱 离心机 热循环仪 手提式盖格计数器 加热块
步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 对每一组 ds cDNA （A 和 B）配制 2 个限制性内切核酸酶消化反应（AluI 和 AluI＋Rsal）：
30 ng ds cDNA
3 ul 10×AluI 缓冲液
10 U AluI 或 10 U AluI＋10 U RsaI
加水到 30.0 ul。
37℃ 温育过夜，确保完全消化。
最好使用产生平端的酶。如果不是产生平端的酶，需要另外补平或削平。
2. 65℃温育超过10 min失活内切酶。
3. 激酶处理寡核苷酸 a1 和 b1， 使用如下反应体系（每个反应体系 25 ul）：
18.0 ul H2O
2.5 ul 10 mmol/L ATP
2.5 ul 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液
1.5 ul 3 ug/ul 的寡核苷酸 a1 或 b1
0.5 ul 10 U/ul T4多聚核苷酸激酶
37℃ 温育 60 min。
4. 65℃温育20 min失活激酶。
5. 加入 1.5 ul 的寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 形成 a1/a2 或 b1/b2 连接子。混匀，最高速离心。45℃ 温育 10 min。
6.在 0.5 ml 的 PCR 管里，用合适的连接子为每组 cDNA 配制连接反应（130 ul 每个反应）：
63 ul H2O
13 ul 10× T4 DNA 连接酶缓冲液
30 ul 40％ PEG 8000
1ul 15 mmol/L ATP
10 ul AluI 消化的 cDNA
10 ul AluI/RsaI 消化的 cDNA
2 ul a1/a2 或 b1/b2 连接子
1ul 10 U/ul T4 DNA 连接酶
混匀，16℃温育2 h。
7. 将反应管放于冰上超过10 min。
8. 根据厂家说明书准备 Sephacryl S-300 离心柱。
9. 每个连接反应中加入 1 ul 75 mmol/L 的 ATP 和 1 ul T4 多聚核苷酸激酶。37℃ 温育 30 min。
10. 用 1 倍体积的 25：24 的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提连接反应。
11. 连接产物离心过 Sephacryl S-300离心柱 ，除去未连接的连接子，用 Beckman Accuspin FR 离心机的吊桶转子室温，400 g 离心 2 min。
12. 两组 cDNA ， 各配制 50 ul PCR反应体系：
35 ul H2O
5 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
3 ul 25 mmol/L MgCl2
1 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物
0.5 ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
5 ul 0.2 ng/ul 连接好的 cDNA A 或 cDNA B
0.5 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。
13. 用下面的 PCR 程序扩增 cDNA ：
30 个循环：
1min 94℃ （变性）
1 min 50℃ （复性）
2 min 72℃ （延伸）
25 s 72℃ （自动延伸）
对于没有自动延伸的热循环仪，延长延伸时间为 2～4 min。
14. 用琼脂糖凝胶电泳分析 5～10 ul 扩增好的 cDNA， 确定扩增 cDNA 的大小范围 （150 bp～1. 5 kb， 大部分为 250 bp）
15. 对两组扩增好的 cDNA， 各配制以下由放射性标记的测试 cDNA 的 PCR 反应体系 （每个反应体系 100 ul）：
77 ul H2O
10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
6 ul 25 mmol/L MgCl2
2 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物
1 ul 稀释的［32P］ dCTP
1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
2 ul A0 或 B0 cDNA （约 0.4 ug）
1 ul 5 U /ul Taq DNA 聚合酶
加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。
16. 对两组扩增好的 cDNA， 各配制 3 或4 个由生物素标记的驱动 cDNA 的 PCR 反应体系（每个反应体系100 ul）：
73.3 ul H2O
10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
6 ul 25 mmol/L MgCl2
6.7 ul 驱动 dNTP
1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
2 ul cDNA A0 或 cDNA B0 （1～５ ng）
1 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
加入几滴无菌的 PCR 级矿物油覆盖反应体系。
17. 用步骤 13 中的 PCR 扩增程序进行测试和驱动 cDNA 的合成。
18. 按厂家说明，用商业化的阴离子交换 PCR 离心柱（Qiagen）纯化扩增的 cDNA，去除未掺入的核苷酸、引物和盐。
19. 用分光光度计定量产物核酸。
20. 配制 2 个杂交反应（［32P］ An-Bio-Bn 和［32P］ Bn-Bio-An）。在一个 1.5 ml 硅烷化的微量离心管里，用乙醇沉淀 1 ug 放射性标记的测试 DNA 和 20 ug 的生物素标记的驱动 DNA，不要冷冻。风干沉淀，当沉淀刚刚干时，用吸头轻轻吹吸，重新溶于 5 ul HEPES 缓冲液。用手提式盖格计数器检测重新溶解的核酸溶液。
21. 转移重新溶解的 DNA 到一个 0.5 ml 的PCR管里。加入 5 ul 68℃ 的 2× 杂交缓冲液进行差减杂交。轻轻吹吸混匀，加入数滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖 DNA 溶液。最高速离心几秒。
22. 把两个管子在 95℃加热 10 min， 然后在 1 h 内慢慢冷却到 68℃，并继续在 68℃温育 2 h （快速杂交）。
23. 混合 7 ul 1 mol/L的 NaCl 和 140 ul HEPES 缓冲液，加热到 68℃。加入到杂交反应中稀释反应。混匀，最高速简单离心。冷却到室温。
24. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提前的总量计算）。
25. 每管中加入15 ul 链霉亲和素，涡旋混匀，室温温育 5 min。
26. 每管用等体积的 25：24 的苯酚/氯仿抽提。保留水相转移到新的管里。
27. 每管的水相中加入 10 ul 链霉亲和素。混匀，室温温育 5 min。
28. 用苯酚/氯仿和氯仿各抽提两次。测量每管的水相体积。
29. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提后的总量计算）。
被去除掉的测试cDNA的百分比用以下等式估算：
％ 去除的测试CDNA＝100 一（酚抽提后总量 ×100/酿抽提前总量）
30. 用 An 或 Bn 测试 cDNA 和合适的驱动 cDNA 重复差减的过程（步骤 15～29）。驱动 cDNA 的选择由差减的策略决定。用 An 或 Bn 驱动 cDNA 进行快速杂交（2 h），用 A0 或 B0 驱动 cDNA 进行长时间杂交（30～40 h）。差减的进程用隙缝斑点杂交检测。
31. 用步骤 13 的程序扩增 5 ul 差减 cDNA （An 和 Bn）。用一个商业化的阴离子交换 PCR 离心柱纯化 PCR产物（如Qiagen）。
32. 用在连接子上有剪切位点的合适限制酶（针对于这里所用的连接子，如 Ec0RI 和 EcoRV）消化 cDNA。
33. 苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化消化的 cDNA。
34. 把 DNA 连接到合适的载体中（如 EcoRI 或 EcoRV 切开的 pBluescript）。
35. 转化载体到感受态细菌里。
36. 铺板培养差减文库。
值得先通过滴定文库以获得单克隆。确定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。
插入片段应当是 250 bp 左右。如果插入的片段 ＞500 bp， 则可以认为是插入了两个片段。
37. 从每个起始滤膜制备 4 个重复的印迹。
38. 按照厂家说明，变性、中和和交联印迹。
39. 用差减探针杂交这些重复的滤膜。
40. 从库里随机（如果估计库里绝大多数是差异表达的基因）或按照探针的杂交结果挑取 50～100 个差异表达的克隆。准备小量的质粒 DNA。
41. 对每个质粒里的插入片段进行测序，把含有相同序列的克隆归在一起。
42. 用起始组织的 RNA 分 析 ［如 Northern 印迹、 RNase 保护分析、定量 RT-PCR 或者原位杂交确定这些克隆是否确实是差异表达的。
注意事项
常见问题
1. 材料
A 和 B 类细胞的双链 cDNA （ds cDNA）
2. 试剂
ALuI 和 10×ALuI 缓冲液
RsaI
10、15 和 75 mmol/L 的 ATP
10 U/ul T4 多聚核苷酸激酶和 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液
寡核苷酸引物
3 ug/ul a1： 5'-TAG TCC GAA TTC AAG CAA GAG CAC A-3’
2.5 ug/ul a2： 5'-CTC TTG CTT GAA TTC GGA CTA-3'
3 ug/ul B1： 5'-ATG CTG GAT ATC TTG GTA CTC TTC A-3'
2.5 ug/ul B2： 5'-GAG TAC CAA GAT ATC CAG CAT-3’
10 U/ul T4 DNA连接酶和 10×T4 DNA连接酶缓冲液
40％（m/V）聚乙二醇 8000（PEG 8000）
25：24（V/V）苯酚/氯仿（平衡酚配制）
氯仿
5 U/ul Taq DNA聚合酶和 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
25 mmol/L MgCl2
10 mmol/L 4dNTP 混合物
矿物油，PCR级，无菌
800Ci/mmol ［α-32P］ dCTP （10 Ci/ul）
驱动 dNTP 混合物
乙醇
1 mol/L 和 5 mol/L NaCl
HEPES缓冲液
2× 差减杂交缓冲液
链霉亲和素溶液
EcoRI 和 10×EcoRI 缓冲液或 EcoRV 和 10× EcoRV 缓冲液
EcoRI 切开的 pBluescript 载体
EcoRV 切开的 pBluescript 载体
转化感受态菌株
3. 耗材
放射性标记的差减探针
0.5 ml 的 PCR 管
Sephacryl S-300 离心柱（Amersham Pharmacia Biotech）
Beckman Accuspin FR离心机和吊桶转子或类似的其他离心机
热循环仪
阴离子交换PCR离心柱（Qiagen）
1.5 ml微量离心管，硅烷化
手提式盖格计数器
加热块
<link />来源：丁香实验
