通过 PCR 方法对微量 DNA 进行定量分析实验

DNA
蛋白酶消化缓冲液 20 mg ml蛋白酶K (储于-20℃) 用 50 mmol L Tris . Cl 10 mmol L EDTA pH 7.4 缓冲的酚（储于室温） 24 ：1（V V)氯仿 异戊醇 10 mol L乙酸按 冰冷的100%乙醇 70%乙醇 TE缓冲液 pH 7.5 反应混合体系 矿物油 0.8 U μL Taq DNA 聚合酶 用于杂交的寡核苷酸引物
经高压灭菌的螺口微量离心管 微量毛细吸管或带一次性可弃吸头和塞子的正压移液器或使用带滤芯吸头的微量移液器

1) 将细胞或组织样品，放人螺口的微量离心管中，每2X1O⁶细胞加人100μL蛋白酶消化缓冲液，并加人20 mg/ml蛋白酶K至终浓度为100μg/ml,将样品放置于50℃过夜。

通常需要设置几个不含病毒序列的样品作为阴性对照，要注意避免其他无关DNA序列污染细胞或组织样本。最好是按目的序列可能性递增的次序处理样品。抽提应在远离处理PCR产物和其他大量DNA质粒的地方进行。操作时戴一次性手套，并且频繁更换。

2) 使用200μL微量毛细吸管轻轻上下吹吸以混匀样品。加人100μL缓冲液平衡酚，轻轻混匀；加人100μL氯仿/异戊醇（24 : 1),轻轻混合；高速离心5 min,将水相 (含有DNA)转移人另外一个新的离心管中。

螺口微量离心管和微量毛细吸管头可以减少来自微量离心机和自动移液器造成的浮质污染。每种试剂需用一根吸管。尽管带一次性可弃吸头和塞子的正压移液器较昂贵，但比微量毛细吸管更容 易使用。应避免使用曾用于PCR产物或大量质粒DNA离心的离心机。

3) 再一次用蛋白酶消化缓冲液抽提有机相（约为原体积的1/2)，室温高速离心5min，水相转移合并到步骤2所得到的水相中。

4) 用等体积的氯仿/异戊醇（24：1)抽提水相2次，每次室温高速离心5 min,以分离水相和有机相。

5) 最终得到的水相加入10 mol/L乙酸铵，终浓度为2.5 mol/L,再加人2.5倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀。干冰上放置30 min。4℃高速离心15 min。将沉淀用 70%乙醇洗1次，离心，干燥。

6) 将沉淀用pH7.5的TE重悬（约2 X 1O⁶细胞的DNA提取物溶于100 中，5〜 100 ng DNA/μL)。储于 4℃。

7) 取小份溶液和标准DNA同时在琼脂糖凝胶电泳，或以溴化乙锭打点定量的方法估计DNA的含量。

8) 准备几个小管加人来源于非感染细胞或组织的DNA, 1管加人110 ng DNA, I管加 人90 ng DNA,其余的加人100 ng DNA。利用这些小管按以下方法对目的序列进 行一系列10倍稀释：将已知量（如20 000个分子）的含有目的序列的DNA加人 1lO ng小管中，然后混合。取1/10到另一 100 ng小管中混合，再取1/10到另一 100 ng小管中，如此重复直至小管中含目的序列的DNA<10分子，再从此管中取 1/10加人到90 ng DNA小管中，每管体积应<71μL。

9) 对于每一个扩增反应，分别准备含有24 μL反应混合液的螺口微量离心管，并加人 足量的无菌水，终体积为100μL (加人DNA和Taq DNA聚合酶以后，步骤10和12)混匀后每管覆盖100μL矿物油，确保反应混合物的表面被完全覆盖。

10) 只打开那些将包含相同样品的管子，每个相应的管子中加人100 ng样品DNA，然后盖上盖子，稍加离心使其混匀。加好其他阴性对照之后，应该从无病毒的对照开始，然后按含有目的序列的可能性递增的次序加入样品DNA,最后加连续稀释管。

11) 在水浴或自动热循环仪上，于94℃变性10 min。

12) 打开管子（包含相同样品），并且加人5μL 0. 8 U/μL的Taq DNA聚合酶。盖紧盖子，重复步骤10〜12，处理下一套同样的样品。

13) 管子稍加离心一下，55℃ 2 min (复性），72℃ 3 min (延伸）。按以下参数进行PCR反应。

29个循环: 1 min 94℃ (变性)

1 min 55℃ (复性)

1 min 72℃ (延伸)

1个循环： 7 min 72℃ (延伸) 最后储存于4℃

15) 取小份反应物（1/10反应体积）在合适的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，应包括能够在溴化乙锭染色和放射自显影时均能显迹的DNA标准分子质量泳道。凝胶进行染色和拍照。凝胶用溴化乙锭染色后，对应于来自宿主染色体特定DNA的PCR产物的DNA片段应该很容易看见，并可估算每个扩增反应的效率。如果看到其他的带，特别是大分子质量带，也不要感到奇怪，那是一些非特异性PCR产物。

16) 将凝胶上的DNA转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜，如果需要，可通过紫外交联将DNA固定到膜上。预杂交并用末端标记的、对目的序列特异的寡核苷酸探针进行杂交，通过放射自显影或Phosphorimagei成像分析。

如果每个扩增反应的效率类似的话，那么预期的结果应该是在重构的系列稀释样品中，合适大小的标记条带的强度也应随之减弱，在阴性对照中应该没有同样大小的条带，实验组样品的条带强 度也会有所变化。取决于探针和杂交的严紧性及洗膜条件，也许会看到探针对大量内部对照产物的非特异性吸附。通常也能看到一些少量的比主要的特异PCR产物迁移率稍大或稍小的PCR产物，特别是在高拷贝的情况下。

假设每个扩增反应的效率是类似的，那么可以通过与系列稀释的样品的比较来估计每个样品中目的序列的分子数。

17) 进一步的定量分析，可以通过在沸水中加热15 min的方法，将用过的探针从膜上剥离下来，并用针对宿主的单拷贝序列的特异性探针进行杂交。通过密度扫描进行信号定量（按照密度计制造商的使用说明进行操作）并从一系列稀释度中计算标准曲线，校正宿主序列的信号。通过与标准曲线的比较确定实验组样品中的分子数。

理想的标准曲线应该是放射自显影的信号强度的对数DNA量的对数成线性关系。然而完全的线性关系也许不必要，也不可能斜率就是1。在标准曲线的髙端（每个细胞相当于0.1〜1个拷贝），它可能是一平台。如果这会引起定量困难，就必须减少扩增循环数或改变其他参数。