​非洲爪蟾的整体原位杂交

1) 在2%半胱氨酸，pH 7.8的溶液中培养非洲白化爪蟾的胚胎3〜10 min以除去胚胎外的胨胶层。

2) 将胚胎转移到5 ml螺旋盖玻璃小瓶中，等胚胎沉淀后，移去大部分的液体，并向小瓶中加入MEMPFA缓冲液。室温下培养30 min并轻轻摇晃以固定胚胎。

3) 用PBS取代MEMPFA缓冲液室温下洗3次，每次30 min。

4) 依次用50%、70%和100%甲醇室温下使样本脱水，每种溶液浸泡10 min。

5) 室温下用100%甲醇洗3次，每次10 min。-20℃保存。

6) 依次加入1 ml的75%、50%和25%甲醇/PBT,室温温育5min，使样本再水化。

7) 室温下用PBT洗3次，每次5 min。使用玻璃针将胚腔刺破。

8) 用 500μL PBT 中加 0.1 mol/L TEA 缓冲液，pH 7.8 洗 2 次，每次 5 min。

9) 加入1. 25μL乙酐。室温下摇动试管5 min,再加入1.25μL乙酐，再摇5 min。

10) 1 ml PBT溶液洗2次，每次5 min。

11) 室温下再用新鲜加入的1 ml PBT和250μL杂交溶液B洗10 min。

12) —旦胚胎在溶液中沉下，用500μL新鲜的预杂交溶液B预杂交：在60℃摇晃的水浴中孵育10 min。

13) 换成500μL新的预杂交溶液B，60〜65℃预杂交5 h以上。

14) 用加有1μg/ml地高辛标记探针的500μL杂交溶液B，60〜65℃杂交过夜。

15) 接下来用酶探测RNA杂交物

所有的溶液都要经过DEPC处理或者高压灭菌以抑制RNA酶活性。样本干燥会导致背景的增强，整个过程中样本都要有液体覆盖以避免干燥。因此，换液时始终保持样本上覆盖一定量的液体。这样做同样可以避免物理损坏或者丢失样本。在固定步骤中保持胚胎处于悬浮状态是很重要的，因为不这样做样本就会变平。如果同时需 要分析很多胚胎，则需荽使用一个较大的容器（如一个大闪烁管）以避免胚胎聚集成块