肽适配体的亲和力成熟实验

质粒 DNA 酵母株
Taq 聚合酶 10×缓冲液 引物 dATP dGTP dCTP dTTP MgCl2 MnCl2 完全极限（CM） 缺失成分培养基和平板 Xgal 平板
PCR 管 PCR 纯化柱 自动热循环器 30℃ 培养箱

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 制备 PCR 预混合物（共 3.775 ml）：

500 ul 10×Taq 聚合酶缓冲液

5 ul 1 mol/L MgCl₂

10 ul 100 mmol/L dATP

10 ul 100 mmol/L dGTP

50 ul 100 mmol/L dCTP

50 ul 100 mmol/L dTTP

125 ul 20 umol/L 引物 1

125 ul 20 umol/L 引物 2

2.9 ml 水

2. 对每一个样品，加入下列试剂到 PCR 管中：

12 ul 水

1 ul 肽适配体表达载体

10 ul Mg^2+/Mn²⁺ 溶液

76 ul PCR 预混合物

1 ul Taq 聚合酶（5 U）

3. 用下列 PCR 反应程序进行扩增反应：

4 个循环：

30 s 95℃ （变性）

1 min 55℃ （复性）

1 min 72℃ （延伸）

4. 移出 13 ul 反应混合液到一新的 PCR 管中，新管中预先吸入：

10 ul Mg^2＋/Mn^2＋溶液

76 ul PCR 预混合物

1 ul Taq 聚合酶

用同样的 PCR 程序扩增。

5. 重复总共 10 轮的扩增。

6. 用 PCR 纯化柱或琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR 产物。

7. 用 Ava II 消化纯化的 PCR 产物，然后按照标准的亚克隆技术将其亚克隆到经 II 酶切过的 PJM-I1中。

8. 用乙酸锂酵母转化法将 pBait 和 pBR1840 转入 EGY48 中。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上筛选转化株。

9. 用高效乙酸锂方法将 10～50 ug 突变的肽适配体库转化含 pBait 和 pBR1840 的 EGY48。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 平板上筛选转化株。

10. 收集转化株，测定平板效率。

11. 接种约 5 个库等价物到 1 ml Gal/Raf/CM-His、 -Ura、-Trp 液体培养基中。于 30℃ 振荡培养 4 h。

12. 室温下，于 3000 g 离心 4 min。弃上清，将酵母沉淀重悬于 1 ml 无菌水中。

13. 将酵母涂布到 15 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp， X-gal 平板上，于 30℃ 培养至克隆出现（约 2 天）。

14. 将蓝色克隆划线接种到一 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 主平板上并于 30℃ 培养 1 天。

15. 将主平板复印到 10 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、X-gal 平板和 Glu/ CM-His、 -Ura、-Trp、X-gal 平板上。

16. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并重新导入，含有 pBait 和 pBR1840 的酵母株 EGY48 中以再次验证表型。

17. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并对可变区进行测序。

1. 材料

质粒 DNA：肽适配体质粒，pBait，pJM-1， pRB1840（1-LexAop-LacZ 报道质粒）和 pJK103

酵母株：EGY48 Mata ura3 trpl his3 3LexA-operator-leu2

2. 试剂

5 U/ul Taq 聚合酶和 10×缓冲液（Life Technologies）

1 mol/L MgCl₂

100 mmol/L dATP

100 mmol/L dGTP

100 mmol/L dCTP

100 mmol/L dTTP

20 umol/L 引物 1： 5'-CCGCCGCCTGAATTCATGAGCGATAAAATTATTCAC-3'

20 umol/L 引物 2： 5'-CGGGGCGATCATTTTGCACGGACC-3'

Mg²⁺/Mn²⁺ 溶液：45 mmol/L ，MgCl₂ 和 5 mmol/L MnCl₂

PCR 纯化柱（可选；如 Qiagen）

完全极限（CM） 缺失成分培养基和平板，补加 2％ （m/V） 葡萄糖 （Glu） 或 2％ （m/V） 半乳糖和 1％ im/V） 棉籽糖 （Gal/Raf）：

Glu/CM-His、-Ura （10 cm 平板）

Glu/CM-His、-Ura、-Trp （10 cm 平板）

Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp （液体培养基）

Xgal 平板

Glu/CM-His， -Ura， -Trp， X-gal （10 cm 平板）

Gal/Raf/CM-His， -Ura， -Trp， X-gal （10 cm 和 15 cm 平板）

3. 耗材

PCR 管

自动热循环器

30℃ 培养箱