随机序列库的纯化

1. 寡核苷酸合成完毕后，去保护，从固相支持物上切下，然后将溶液冻干（在浓缩的氢氧化铵中），或者用 10 倍体积的正丁醇于 -70℃ 放置＞1h 将寡核苷酸沉淀出来。

2. 制备一块变性的聚丙烯酰胺胶。

3. 用 100～200 ul 的水或缓冲液（如 TE 缓冲液，pH 8.0） 重新溶解冻干的或沉淀出的寡核苷酸，加入等体积的 2×上样染料。上样前将样品加热到 75℃ 热变性 5 min。 每一 2 cm×2 cm×1.6 mm 的孔中加入约 20％ 的 1 umol 合成的寡核苷酸进行电泳分离。

4. 将胶放到塑料膜包裹的荧光薄层层析板上，在紫外灯的照射下用刀片切下寡核苷酸产物（通常为最暗的阴影条带）。

5. 按如下步骤将寡核苷酸从胶条中洗脱出来：

5.1 为了帮助寡核苷酸从丙烯酰胺基质中扩散出来，用力让胶条挤过小孔注射器以使之变为粉碎的颗粒。

5.2 将碎胶放入一个能耐受极端温度的 13 ml 的离心管中。

5.3 每 0.5 ml 的胶条（一般相当于 1～2 个加样孔的量）加入 3 ml 的 TE 缓冲液，pH 8.0，将样品于 -80℃ 放置 30 min 或直到样品冻成固体。

5.4 将离心管放于热水浴中迅速解冻样品，然后于 90℃ 浸泡 5 min。将样品放于旋转混合器上于室温洗脱 DNA 过夜。

6. 用 5mol/L NaCl 储液将寡核苷酸洗脱液的盐浓度调整到 0.3 mol/L， 然后加入 3 倍体积的乙醇以沉淀寡核苷酸库。于 -20℃ 放置 3 h，然后于 4℃ 以最高转速离心。冻干。用 TE 缓冲液（pH 8.0，防止核酸酶污染或 pH 的剧变）重溶合成的库。

图 1 库的设计、合成和大规模扩增的流程图

1. 材料

DNA 库

2. 试剂

氢氧化铵

正丁醇

TE 缓冲液，pH 8.0

尿素上样缓冲液，2×

5 mol/L NaCl

乙醇

3. 耗材

荧光薄层层析板（VWR），塑料膜包裹

紫外灯

剃刀刀片

小孔注射器

能耐受极端温度的 13 ml 离心管（Sarstedt）

90℃ 水浴

旋转混合器