粗制品的DNA酶足迹分析法

DNA酶足迹分析常用来寻找粗制品中的蛋白质，因而提供了一种在纯化过程中采用的分析方法。通过改变条件，如在反应体系中加入大量的竞争性DNA，或增加反应中盐的浓度，可抑制非特异性的DNA结合蛋白结合到标记的DNA上。

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含有DNA结合位点的质粒DNA
适当的限制性内切核酸酶 100%乙醇及冰冷的70%乙醇 TE缓冲液 [α-32P] dNTP (3000〜6000 Ci mmol)水溶液 1O× Klenow片段缓冲液 E. coli DNA聚合酶1的Klenow片段 5 mmol L 4dNTP 混合液 脱氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3.L4.5) 分析缓冲液A或B 干冰 DNA酶I终止缓冲液 DNA酶I储存缓冲液 甲酰胺加样缓冲液
10 mL 一次性塑料管 硅烷化1.5 mL微量离心管 可调节水浴锅（±0. 1℃) 12 in×7.5 in大小的玻璃或不锈钢碟 有盖子的塑料微量离心管 6 mm宽间隔12 mm的DNA测序胶梳 平头Hamilton注射器（29-G 用于0.4 mm胶）

1) 同基本方案中的步骤1〜7制备32P单末端标记的DNA。

2) 从各稀释度中找出能产生约50%无切口 DNA (0. 1 mg/mL)的DNA酶I浓度。建 立一个200μL的包括探针和分析缓冲液的反应体系，但不加蛋白质，如基本方案的步骤10。加入5μL稀释的DNA酶I，轻轻混合，稍加离心。

3) 温育2 min,如基本方案步骤18所述终止反应。乙醇沉淀，在测序胶上分析反应产物。

4) 按基本方案进行足迹反应。不同的是，用恒定体积的、已知具有所需活性的粗组分代替不同量的蛋白质。进行一组不同分析条件的实验来寻找合适的 反应条件。

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