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DNA 酶 I 足迹分析法实验

实验分类:

生物化学实验

最新修订时间:

简介

本分析方法用来检测DNA上特异的蛋白质结合位点。位点上结合的蛋白质可保护 D N A 的 磷 酸 二 酯 键 骨 架 免 于 受 D N A 酶 I 催 化 的 水 解 。 水 解 后 D N A 片 段 在 变 性DNA测序胶上分离,通过放射自显影可使结合位点显示出来。足迹法已进一步发展成为确定DNA上每个蛋白质结合位点各自的结合曲线的定量技术。对于有协同作用的位点,可对它们的结合曲线进行联立数值分析,从而分解出固有结合及协同组成。来源:《分子生物学实验指南》第五版

来源:丁香实验

操作方法

DNA酶I足迹分析法

1)用限制性内切核酸酶消化约5 pmol质粒,使得在距第1个蛋白质结合位点25〜100 bp处产生一个3'凹端2) DNA用乙醇沉淀,用1 mL冰冷的70%的乙醇洗1次,在Speedvac真空旋转蒸发器中干燥。DNA沉淀重溶于5μL TE缓冲液中。3) 加入适当的[α-32P] dNTP水溶液,每种各50μCi,再加入5μL 10× Klenow酶缓冲液,加水至49μL;加1μL Klenow酶(

用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数

1) 用胶片扫描装置构建一个该胶片的二维数字图像。2) 对每个结合位点的被保护DNA区带,在每条泳道 上(也就是各配体的每一浓度)的光密度进行积分。最好是将连续的条带群作为单独一组(即图中的方块)来分析。只要所有被包括在内的条带均匀地出现,这种简化是合适的。在所有的泳道上密度最大而且密度较相似的条带之间的最低密度处(也就是高度保护区)画出边界以选定各方块的两端。很关键的是,胶片的每泳道中各方块内都

粗制品的DNA酶足迹分析法

1) 同基本方案中的步骤1〜7制备32P单末端标记的DNA。2) 从各稀释度中找出能产生约50%无切口 DNA (0. 1 mg/mL)的DNA酶I浓度。建 立一个200μL的包括探针和分析缓冲液的反应体系,但不加蛋白质,如基本方案的步骤10。加入5μL稀释的DNA酶I,轻轻混合,稍加离心。3) 温育2 min,如基本方案步骤18所述终止反应。乙醇沉淀,在测序胶上分析反应产物。4) 按基本方案进行

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